基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法

摘要

本发明公开了基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法。首先根据食品致病菌的高保守性DNA序列作为检测目的片段，设计三条PCR引物，然后由引物1制备得到磁性引物，由引物2制备得到TBR引物，引物3为普通的PCR引物，当检测体系里存在目标基因片段时，随着PCR过程的进行，磁性引物会发生扩增，磁性粒子上便直接带有三联吡啶钌分子修饰的双链核酸产物。当没有目的基因片段存在下，磁性引物不会发生扩增，因而不会出现带有信号分子的产物。之后再通过磁分离和原位的电化学发光检测手段，此方法实现了快速，高灵敏，安全，特异的检测目的基因片段的目的，很适合在实际检测的过程中得到推广。

主权项

一种基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）设计引物：根据食品致病菌的保守序列进行设计，每种食品致病菌的检测引物为3条，分别命名为引物1、引物2和引物3，其中：引物1的5’端修饰有功能基团和连接子；引物2的5’端修饰有功能基团；引物3为核苷酸序列，其与引物2预扩增得到的片段包含或相同于引物1与引物2扩增得到的片段；（2）制备磁性引物和TBR引物：引物1通过其功能基团与功能化的磁性粒子上的功能基团反应，得到磁性引物；引物2通过其功能基团与活化的三联吡啶钌进行反应，得到TBR引物；（3）PCR反应：模板为待测样品DNA，引物为引物3以及步骤（2）制备的磁性引物和TBR引物；（4）分离纯化：将步骤（3）所得的PCR产物进行分离纯化，得到带有三联吡啶钌的PCR产物的磁性粒子；（5）检测：在带有三联吡啶钌的PCR产物的磁性粒子中加入分析液，电化学发光检测仪器检测带有三联吡啶钌的PCR产物的磁性粒子的ECL信号，ECL信号值高于阈值即表明样品中含有食品致病菌，根据引物的种类即可判断样品中的食品致病菌的种类；引物1中所述的功能基团为氨基、羧基、磷酸基、生物素、链霉亲和素、羟基或巯基；所述连接子为TTTTTTTT，是降低磁性引物空间位阻效应的聚胸腺嘧啶；引物2中所述的功能基团为氨基；步骤（1）中所述的食品致病菌的保守序列为食品致病菌的16S‑23S启动子间基因片段或食品致病菌的毒力基因片段；步骤（2）中所述功能化的磁性粒子中的功能基团为氨基、羧基或巯基，其功能基团是能与引物1上的功能基团进行反应；步骤（5）中所述的阈值是指3组或以上的阴性对照样品的平均光信号值加上其3倍标准偏差。