胸腺肽α1的固相合成工艺

摘要

本发明涉及胸腺肽α1的固相合成工艺，该工艺步骤如下：(1)NH2-Asn(Trt)-CTC树脂的制备；(2)AA(1-27)-Asn(Trt)28-CTC树脂的合成；(3)Ac-AA(1-27)-Asn28(Trt)-CTC树脂的制备；(4)用裂解剂制备胸腺肽α1粗肽；(5)胸腺肽α1粗肽的纯化。

主权项

一种胸腺肽α1的固相合成方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：（1）NH2‑Asn(Trt)‑CTC树脂的制备：Fmoc‑Asn(Trt)‑CTC树脂加入至反应器中，加入DMF，打开氮气自下而上柔和冲混液体和树脂，除去液体，然后向反应器中加入哌啶/DMF溶液进行反应，反应完毕抽去液体，用DMF洗涤，再加入哌啶/DMF溶液，搅拌反应后抽除，用DMF洗涤，洗去脱下的Fmoc保护基，（2）AA(1‑27)‑Asn(Trt)28‑CTC树脂的合成：取Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH，HATU，溶于DMF中，加入冷却的NMM，激活后加入到反应器中反应，以茚三酮显色法检测为准，然后抽滤除去反应液，加入DMF洗涤，按照胸腺肽α1氨基酸序列，重复以上的操作步骤，将其余26个氨基酸依次偶联到树脂上，然后用哌啶/DMF脱去Fmoc保护，得到AA(1‑27)‑Asn(Trt)28‑CTC树脂，（3）Ac‑AA(1‑27)‑Asn28(Trt)‑CTC树脂的制备：AA(1‑27)‑Asn(Trt)28‑CTC，乙酸酐，吡啶，DMF混合均匀后加入至反应器中反应，抽滤除去溶液；依次加入DMF洗涤，DCM洗涤，MeOH洗涤，转出树脂，减压干燥，得到胸腺肽α1肽树脂，（4）裂解制备粗肽：裂解液，胸腺肽α1肽树脂冰浴下混合反应；然后过滤除去树脂，滤液加入到冰乙醚中沉降，分离制得胸腺肽α1粗肽，其中，裂解剂是：三氟乙酸/二巯基乙醇/水，按照90:5:5的体积配制而成，在‑10℃预冷12小时，（5）胸腺肽α1粗肽的纯化：以TFA溶液为流动相A，乙腈为流动相B；色谱系统采用反相C18，采用梯度洗脱，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶收集液纯度大于90%，峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于90%纯化液，合并所有含量在90%以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，准备二次纯化，以磷酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B；色谱系统采用反相C18采用梯度洗脱，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶纯度大于98.5%，峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于98.5%纯化液，合并所有含量在98.5%以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，进行下一步脱盐纯化，以注射用水为流动相A，乙腈为流动相B；色谱系统采用反相C18填料柱，取第二次纯化得到的目的肽，采用梯度洗脱， 主峰出现时开始收集至无峰出现时结束，合并收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈和大部分的水，制得胸腺肽α1精制液用微孔滤膜精密过滤，冻干。