化学发光磁酶免疫法定量检测RBP4试剂盒

摘要

本发明涉及一种化学发光磁酶免疫法定量检测人血清RBP4水平的医用检验试剂盒。该试剂盒由四个试剂部分组成：特异性鼠抗人RBP4抗体I包被的免疫磁珠、酶标记的特异性鼠抗人RBP4抗体II、化学发光底物、相应的标准液和质控液。本试剂盒使用方法为以磁珠微粒作为固相载体，在其表面结合特异性鼠抗人RBP4抗体I而成为RBP4特异性免疫活性磁珠，以酶标记的特异性鼠抗人RBP4抗体II捕获样本中待测抗原RBP4，并在磁珠表面形成双抗体夹心复合物，该复合物上标记的酶能与反应体系中相应的发光底物反应形成稳定发光信号，通过检测光信号的强度从而达到定量检测分析RBP4的目的，具有高灵敏度，高特异性，操作简单迅速的优点。

主权项

一种化学发光磁酶免疫法定量检测RBP4试剂盒的制备方法，其特征在于，a.RBP4免疫磁珠制备：选用商品名Bruker，BioSciences Corporation制造的超顺磁聚合物磁性微球作为磁珠载体，其内部分散着平均直径8‑10纳米的超顺磁性四氧化三铁；将氨基修饰活化的磁珠经PBS缓冲液进行清洗，然后加入到5％戊二醛/PBS溶液中室温避光振荡反应后进行磁性分离，清洗多次后制备得到活化磁珠；取活化磁珠与特异性鼠抗人RBP4抗体I以100μg抗体/mg磁珠比例在室温下孵育，磁性分离后，加入过量的10％BSA溶液以封闭未结合抗体的游离醛基，即得到特异性鼠抗人RBP4抗体I包被的免疫活性磁珠；b.酶标抗体制备：将0.2mg特异性鼠抗人RBP4抗体II溶于1.5mlN′，N‑二甲基甲酰胺中，加入2ml10mg/ml的碱性磷酸酶溶液，将10.8mg1‑乙基‑3‑(二甲基丙基)碳二亚胺盐酸分三次加入，每次间隔1小时，混合物不断搅拌，4℃过夜，于0.01M Tris缓冲液pH7.0条件下进行透析，直至将1‑乙基‑3‑(二甲基丙基)碳二亚胺盐酸透析完全除去，加入等体积甘油，‑20℃冻存；C.标准液制备：准确称量RBP4蛋白标准品，用二甲基亚砜溶解，用校准品稀释液进行系列稀释后成0、5、10、20、40、80、160mg/L标准溶液;d.化学发光底物工作液制备：将剂量范围的1～20μl AMPPD分别溶解在1ml NaHCO3/Na2CO3缓冲液中，得到梯度浓度的AMPPD溶液；以发光底物浓度‑发光强度作一曲线，筛选出发光信号最稳定的发光底物浓度10μl/ml，并以此浓度配制发光底物工作液，在此AMPPD浓度下，根据发光底物反应时间‑发光强度的曲线，确定发光底物加入 反应体系的反应时间为30min。