一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法

摘要

本发明涉及一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法，属于基因克隆技术领域。本发明方法首先配制一种通用缓冲液，Taq DNA聚合酶和T4噬菌体DNA连接酶在该缓冲液中都具有酶活性。将待连接的DNA双链分子加入通用缓冲液中，用Taq DNA聚合酶对DNA做加A处理后，再直接加入T4噬菌体DNA连接酶和线性载体，得到连接产物，进行转化后完成克隆反应。本发明方法省略了Taq DNA聚合酶和T4噬菌体DNA连接酶反应之间DNA分子核酸的纯化步骤，极大提高了实验效率。

主权项

一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤（1）制备一种通用缓冲液，该通用缓冲液中各组分的摩尔浓度为：三羟甲基氨基甲烷（Tris），浓度为250－500毫摩尔/升，氯化镁（MgCl2），浓度为10－20毫摩尔/升，二硫苏糖醇（DTT），浓度为10－20毫摩尔/升，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（ATP），浓度为5—10毫摩尔/升，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP），浓度为100－200微摩尔/升，氯化六氨合高钴（Hexamminecobalt(III)Chloride），浓度为50—100微摩尔/升，用盐酸将通用缓冲液的pH值调至8.0；（2）用高保真DNA聚合酶（如pfu DNA polymerase）通过聚合酶链式反应（PCR）得到双链DNA片段溶液；（3）取2微升步骤（1）的通用缓冲液，加入5微升步骤（2）得到的双链DNA溶液，再加入1微升体积浓度为3单位/微升的Taq DNA聚合酶，在68－74℃下作用5—10分钟，形成含有3末端含有未配对的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）的粘端DNA分子溶液；（4）在步骤（3）的反应体系中加入1微升浓度为50纳克/微升的三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸载体（T载体）和1微升浓度为5单位/微升的T4噬菌体DNA连接酶，室温下反应5－30分钟，使粘端DNA分子和载体DNA分子形成环状的DNA质粒，成为连接产物；（5）取5微升步骤（4）得到的连接产物，置于50微升感受态大肠杆菌细胞溶液，冰浴30分钟，在42℃热处理90秒，冰浴2分钟，再加入200－500微升细菌液体培养基，在37℃摇床上以200转/分的速度培养45分钟后，从中取出200－400微升菌液涂布于含有1毫克异丙基β—D—硫代半乳糖苷（IPTG）和0.8毫克5‑溴‑4‑氯‑3‑吲哚‑6‑D‑半乳糖苷（Xgal）的固体培养基平板上，在37℃温箱培养12－16小时，在平板上克隆出白色和蓝色的大肠杆菌细菌菌落。