联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法，包括如下步骤：首先制备胸膜肺炎放线杆菌多糖抗原，制备兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清并纯化；然后用纯化的兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清偶联液相芯片微球，根据双夹心ELISA原理，建立分型检测猪胸膜肺炎抗体的液相芯片方法，并确定最佳试验条件；最后通过统计学分析确定液相芯片阴阳判定的阈值。此外，本发明还公开了一种液相芯片联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的试剂盒。本发明可同时分型检测猪传染性胸膜肺炎S1-S7型血清抗体，整个反应可在3小时内完成，其快速、敏感、特异和同步检测多个血清型的特点可用于进出境种猪初筛、国内猪场猪传染性胸膜肺炎的诊断和监测。

主权项

一种联合分型检测猪传染性胸膜肺炎抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：①制备胸膜肺炎放线杆菌多糖抗原；②制备兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清并纯化；③制备阴性血清池；④利用步骤①和②得到的多糖抗原和纯化的兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清建立双夹心ELISA方法，以初步获得多糖抗原的工作浓度以及样本血清稀释度；⑤使用步骤②纯化的兔抗胸膜肺炎放线杆菌高免血清与液相芯片的微球偶联；⑥采用液相芯片分型联合检测猪传染性胸膜肺炎抗体，具体步骤为：(a)取偶联有兔抗胸膜肺炎放线杆菌IgG的微球放置室温20～30min，涡旋微球，按胸膜肺炎放线杆菌每个型每次试验需要2000个微球的量，每个型取微球1μL，加入相应的胸膜肺炎放线杆菌多糖抗原，总体积为50μL，37℃振荡作用45min；(b)13000r/min离心3min去上清，用200μL PBS‑TBN重悬微球，洗涤微球1次，离心去上清；(c)加入1∶400稀释的待检猪血清，50μL，同时设猪阳性、阴性血清对照，37℃振荡作用45min，离心去上清，用200μL PBS‑TBN重悬微球，洗涤微球2次，离心去上清；(d)加入生物素标记兔抗猪IgG与PE标记的链亲和素的混合物，37℃作用30min；(e)加入100μL纯水，将悬液转移至96孔酶标反应板，通过Bio‑plexTM200system仪器检测荧光强度值，并用Bio‑Plex Manager5.0 软件分析数据；⑦确定猪传染性胸膜肺炎液相芯片检测阴性或阳性标准判定的阈值。