呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备方法

摘要

本发明为呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒。其检测快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、且对样品纯度要求不高，特异性强，特别适用于大批量样品的检测，为此本发明还提供了专用测试盒的制备及检测方法。其包括洗涤液、显色液A、显色液B和终止液，其特征在于：其还包括包被有呕吐毒素固相抗原的包被板、呕吐毒素(DON)标准品、呕吐毒素(DON)单克隆抗体冻干品以及酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。检测时，取包被板，加入50μL～100μL的DON标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加50μL～100μL抗DON抗体，35℃～45℃孵育0.5h～1h，洗涤液洗3次～5次，加50μL～100μL辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗体，35℃～45℃孵育0.5h～1h，用洗涤液洗3次～5次，加50μL～100μL显色液A和50μL～100μL显色液B，暗处静置10分钟～20分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的DON含量。

主权项

呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备方法，所述酶联免疫吸附检测专用测试盒，其包括洗涤液、显色液A、显色液B和终止液，其还包括包被有呕吐毒素固相抗原的包被板、呕吐毒素（DON）标准品、呕吐毒素（DON）单克隆抗体冻干品以及酶标记的羊抗鼠抗体冻干品，其特征在于：其包括以下步骤，包被板的制作、呕吐毒素DON标准品的制作、呕吐毒素‑牛血清白蛋白DON‑BSA偶联物的制备、呕吐毒素‑卵清蛋白DON‑OVA偶联物的制备、抗呕吐毒素DON单克隆抗体及其溶液的制备、完全福氏佐剂的制备、不完全福氏佐剂的制备、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备；洗涤液的制备；显色液A的制备；显色液B的制备；终止液的制备；所述包被板包被呕吐毒素固相抗原，其采用96或48或24孔微孔板，用10 mmol／L ~100mmol／L  pH9~10 Na2CO3‑NaHCO3的缓冲液作为包被液，将呕吐毒素‑卵清蛋白(DON‑OVA)稀释至0.1µg/m L ~1.0µg/m L，96或48或24孔微孔板各孔加100µl，2℃~8℃放置过夜，弃去包被液，洗涤2次~5次，按加入含1%~5%牛血清白蛋白溶于pH 7~8的磷酸盐缓冲液，2℃~8℃封闭过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置‑20℃~‑40℃冷冻保存；所述呕吐毒素（DON）标准品从呕吐毒素（DON）纯品中稀释得到，稀释液为去离子水，DON浓度为：0.001ng/mL ~ 1000 ng/mL；呕吐毒素‑牛血清白蛋白（DON‑BSA）偶联物的制备：将DON溶解在吡啶中，在反应瓶中加入1一丁基硼酸；混合物在室温下搅拌过夜，产生7，15一氧一(丁基硼)‑脱氧雪腐镰刀菌烯醇；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气；密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌90分钟～120分钟，产生3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然后将残余物溶解于5mL乙酸乙酯中，超声波处理10分钟~30分钟后，6000rpm~15000rpm下离心5分钟~30分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙酯溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓缩后备用；取浓缩物与N‑羟基琥珀酰亚胺( NHS)、二环己基碳化二亚胺（DCC）溶于N,N‑二甲基甲酰胺（DMF）中，室温振荡10 min ~60min，离心；将上清液缓慢滴加到牛血清白蛋白溶于0.01 M ~0.2M NaHCO3溶液中，在2℃~8℃振荡2 hr～3 hr，然后，在0.01 M ~0.2M 磷酸盐缓冲液（PBS溶液）pH 7~8中透析，换透析液3次~8次；冷冻干燥，偶联物‑20℃~‑40℃保存；上述反应成分的比例为：DON：1一丁基硼酸：琥珀酸酐 = (10~1000)mg ：(30~4000)mg ：(10‑2000)mg，3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓缩物：NHS：DCC：BSA = (10~2000)mg ：(3~1000)mg ：(5‑2000)mg：(10‑6000)mg；呕吐毒素‑卵清蛋白（DON‑OVA）偶联物的制备：将DON溶解在吡啶中，在反应瓶中加入1一丁基硼酸，混合物在室温下搅拌过夜，产生7，15一氧一(丁基硼)‑脱氧雪腐镰刀菌烯醇，再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气，密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌90 分钟～120分钟，产生3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然后将残余物溶解于乙酸乙酯中，超声波处理10分钟～30分钟后，6000rpm～15000rpm下离心5分钟～30分钟，取上清液；将沉淀物用乙酸乙醋溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓缩后备用；取浓缩物与N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳化二亚胺（DCC）溶于N,N‑二甲基甲酰胺（DMF）中，室温振荡10分钟～60分钟，离心，将上清液缓慢滴加到卵清蛋白溶于0.01 M ~0.2M NaHCO3溶液中，在2℃~8℃振荡2 hr～3 hr，然后，在0.01 M～0.2M磷酸盐缓冲液（PBS溶液）pH 7～8中透析，换透析液3次～8次；冷冻干燥，偶联物‑20℃～‑40℃保存；上述反应成分的比例为：DON：1一丁基硼酸：琥珀酸酐 = (10～1000)mg ：(30～4000)mg ：(10‑2000)mg，3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓缩物：NHS：DCC：OVA = (10～2000)mg ：(3～1000)mg ：(5‑2000)mg：(10‑8000)mg ；所述抗呕吐毒素（DON）单克隆抗体及其溶液的制备：取呕吐毒素‑牛血清白蛋白（DON‑BSA）偶联物用生理盐水配成0.1µg/µl~10 µg/µl抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为10µg/只~100 µg/只小鼠，以后每隔2周~4周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量10µg/只~100 µg/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP‑2/o以10:1比例混合，离心，去除上清，在50 S～90 S内将0.1 ml ~10 ml 50％聚乙二醇分子量为1500加至细胞中，充分混匀，使其融合，1 min ~3 min后加入10 ml ~50 ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止10 min ~30 min后离心，去除上清；将融合细胞用含5％~30％小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为1×104~1×106饲养细胞/0.1 ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5％~10%CO2，35℃~45℃条件下培养，5天~10天后，每培养孔更换2/3 HT培养液，10天～20天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以呕吐毒素‑卵清蛋白（DON‑OVA）为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP‑2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为（A试验‑A空白 ）/(A对照‑A空白)>2.1；对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个／m1，再取1 ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对10周龄～13周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3 ml/只～0.5 ml/只，8天～10天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5×105细胞/只，5 天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于‑20℃~‑40℃保存；上述反应成分的比例为：DON‑BSA ：生理盐水 = (10~1000) µg ：(0.1~10)m1 。