利用蔗糖转运蛋白基因提高小麦植株磷吸收效率的方法

摘要

本发明公开了一种利用蔗糖转运蛋白基因提高小麦植株磷吸收效率的方法，其步骤包括：A、TaSUT2基因全长cDNA的克隆；B、超表达载体的构建：B-1、用限制内切酶SmaI和SacI分别双酶切中间载体质粒pTSUT4和单子叶高效表达载体pAHC25，电泳后进行胶回收，回收1.9Kb的TaSUT2片段和去除GUS基因的pAHC25载体；B-2、将上酶切后的TaSUT2基因片段连接到pAHC25载体上；B-3、将连接体系转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；C、转基因小麦的获得：将包含编码小麦蔗糖转运蛋白的TaSUT2基因片段连接到载体pAHC25上后，采用基因枪介导的转基因方法，得到转基因小麦植株。本发明通过超量表达TaSUT2基因，使转基因小麦出现提高磷吸收效率和增强低磷响应的表型，发掘了该基因的新功能应用方向。

主权项

利用蔗糖转运蛋白基因提高小麦植株磷吸收效率的方法，其特征步骤包括：A、TaSUT2基因全长cDNA的克隆A‑1、小麦cDNA的获取：提取小麦苗期的叶片总RNA，以2μg总RNA为模板，采用M‑MLV逆转录酶以OligodT引物进行逆转录获得cDNA；A‑2、使用水稻和玉米的蔗糖转运蛋白基因氨基酸序列在小麦EST数据库中进行小麦SUT基因电子克隆的同源检索,将检索到的与之有高度同源性的EST序列用Bioedit中的CAP程序进行第一次电子延伸，得到第一个重叠群；以此序列为探针再进行NCBI的BLASTn检索，重复以上过程，直至没有更多的重叠EST检出，重叠群不能延伸为止；利用ORFfinder程序预测拼接序列的开放阅读框ORF，在预测的ORF两侧设计特异引物，上游：SEQIDNO：2，TCCCCCGGGGGAGACGCGCCGTAGAGTTGATAG,下游：SEQIDNO：3，CGAGCTCGTCAC‑AACCCAAAGACGACACC，上游和下游分别添加SmaI、SacI酶切位点和保护碱基；A‑3、以反转录合成的cDNA为模板，采用高保真DNA聚合酶PrimeSTARHSDNA聚合酶进行PCR扩增，扩增出TaSUT2基因的编码区；取5μLRT‑PCR产物，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测；将胶回收的DNA片段连接到pMD19‑TVector上，转化大肠杆菌JM109菌株，AMP抗性筛选，筛选阳性克隆，酶切鉴定片段大小后测序，测序结果如序列表中SEQIDNO：1所示的TaSUT2基因的cDNA序列，获得正确的克隆片段；B、超表达载体的构建B‑1、用限制内切酶SmaI和SacI分别双酶切中间载体质粒pTSUT4和单子叶高效表达载体pAHC25，电泳后进行胶回收，回收1.9Kb的TaSUT2片段和去除GUS基因的pAHC25载体；B‑2、将上酶切后的TaSUT2基因片段连接到pAHC25载体上；B‑3、将连接体系转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，选取阳性克隆重组转化子，提取纯化质粒，进行SmaI和SacI双酶切重组质粒，37℃酶切3h后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据得到片段的大小，初步判断是否得到了重组质粒，同时经胶回收进一步测序验证，以鉴定构建的转基因表达载体pAHC25‑TaSUT2的正确性；该载体中TaSUT2基因表达受Ubiqutin启动子控制,另外还具有1个受Ubiqutin启动子控制的Bar基因表达盒，可作为抗除草剂双丙氨磷的筛选标记；C、转基因小麦的获得将包含编码小麦蔗糖转运蛋白的TaSUT2基因片段连接到载体pAHC25上后，采用基因枪介导的转基因方法，得到转基因小麦植株。