周期型马来丝虫复合多价DNA疫苗的制备方法

摘要

本发明公开了一种周期型马来丝虫复合多价DNA疫苗的制备方法，包括引物设计、PCR扩增BmGAPDH、BmCPI基因、BmGAPDH、BmCPI基因片段纯化和T载体的连接以及转化、I阳性重组克隆的筛选和鉴定、I重组表达质粒构建与鉴定、重组质粒的大量抽提纯化等步骤。本发明制备方便，效果好；以我国流行的周期型马来丝虫为研究对象，构建了周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂/3-磷酸甘油醛脱氢酶真核表达重组质粒。试验结果证明了该复合多价DNA疫苗可诱导小鼠产生特异性的免疫应答反应，取得满意效果，制备周期型马来丝虫复合多价DNA疫苗获得成功。

主权项

1.一种周期型马来丝虫复合多价DNA疫苗的制备方法，其特征是：包括下列步骤：（一）引物设计根据GeneBank中周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的已知序列，应用Primer Premier5.0软件设计引物,在上下游引物的5′端分别引入BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点,起始、终止密码子以及保护性碱基；BmGAPDH-P1:上游引物5'-CC GGATCC ACC ATG ATT AAC ATT GAC TAT-3'，下划线序列为BamH Ⅰ酶切位点BmGAPDH-P2:下游引物5'-CC CTCGAG TTA GGT TGC TGT AGC CAT AT-3'，下划线序列为Xho Ⅰ酶切位点根据GeneBank中周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的已知序列，应用Primer Premier5.0软件设计引物,在上下游引物的5'端分别引入Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点,起始终止密码以及保护性碱基；BmCPI-P1:上游引物5'-CC GCTAGC AAC GAT GTC AAT AAA AGA AG-3'，下划线序列为Nhe Ⅰ酶切位点BmCPI-P2:下游引物5'-CC GGA TCC CTA TGC ACC AAT TAA AAC-3'，下划线序列为BamH Ⅰ酶切位点；（二）PCR扩增BmGAPDH、BmCPI基因计算引物Tm值，P1Tm=62.02,P2Tm=64.94,在0.5m1Eppendorf管中按下表建立25μl的PCR反应体系：反应体系在冰上调制，混匀，离心后置PCR仪，94℃预变性3min后，94℃变性45秒，57℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃再延伸7min，4℃冷却终止反应。扩增完毕后，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定；计算引物Tm值，P1Tm=62.01,P2Tm=61.99,在0.5m1Ep管中按下表建立25μl的PCR反应体系：反应体系在冰上调制，混匀，离心后置PCR仪，94℃预变性3min后，94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环，最后72℃再延伸10min，4℃冷却终止反应。扩增完毕后，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定；（三）BmGAPDH、BmCPI基因片段纯化和T载体的连接以及转化感受态大肠杆菌的制备：(1)取E.coli DH5α用接种环划种于1.5%琼脂LB平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现；(2)次日，从LB平板上挑一个直径约2mm的单克隆菌落，接种至3ml LB培养基中,于37℃250rpm振荡培养过夜；(3)取菌液0.3ml加入30m1LB液体培养基中，37℃250rpm振荡4-6小时，使之处于对数生长期,冰浴1h；(4)将培养液分装到1.5ml Ep管4℃离心，4000rpm×5min，弃上清，加入冰浴0.1mol/L MgCl₂ 100μl悬浮，冰浴30min；(5)再于4℃离心,4000rpm×5min，弃上清，加入冰浴0.1mol/L CaCl₂-10%甘油溶液300μl悬浮，-70℃保存备用；纯化BmGAPDH、BmCPI基因片段：(1)取50μl PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下切割含目的基因的凝胶,移入1.5ml预先称重的Ep管中，称胶重；(2)按400μl/100mg琼脂糖凝胶比例加入Binding Buffer，50℃-60℃水浴10min，使胶彻底融化。加热融胶时，每2min混匀一次；(3)将融化的胶转移到离心柱中，室温放置2min，8000rpm室温离心l min；(4)取下离心柱，弃收集管中的废液，将离心柱放入同一收集管中，加入500μl Wash Solution，8000rpm室温离心lmin；(5)重复步骤(4)一次；(6)取下离心柱，弃收集管中的废液，空管l2000rpm离心lmin；(7)将离心柱置于新的灭菌1.5ml Ep管中，在柱子膜中央加入30μl Elution Buffer，室温放置2min；(8)12000rpm室温离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。BmGAPDH、BmCPI基因片段和pGEM-T载体的连接：在一个灭菌0.5ml Ep管中，建立如下10μl连接体系：在一个灭菌0.5ml Ep管中，建立如下10μl连接体系：混匀，4℃连接20h，同时设置不含PCR产物的连接反应体系作为阴性对照；pGEM-T/BmGAPDH、pGEM-T/BmCPI连接反应物的转化：（1）取一管贮存于－70℃冰箱的DH5α感受态细胞，冰浴化开；（2）取连接反应物10μl加入新鲜制备的大肠杆菌DH5α感受态，同时设立阴性对照和阳性对照，轻轻混匀，冰浴20min；（3）于42℃热休克90s，迅速转入冰浴中，继续冰浴3min；（4）加入200μl LB液体培养基，于37℃缓摇孵育45min；（5）取培养物，涂于预先制备好的1.5%琼脂LB平板，25ml琼脂LB液中加入100mg/ml Amp25μl、24mg/ml IPTG40μl和20mg/ml X-gal50μl，正面于室温放置30min，待胶表面没有液体流动时，倒置平板，于37℃温箱过夜培养12～16h后，置于4℃2h；（四）pGEM-T/BmGAPDH、pGEM-T/BmCPI阳性重组克隆的筛选和鉴定阳性重组克隆的筛选：(1)从琼脂平板上挑取直径2mm的白色单斑,接种于3ml LB液体培养基中，37℃恒温250rpm震荡培养过夜12h，抽提质粒；(2)取过夜菌液1.5ml加入Ep管内，l2000rpm离心2min，彻底弃上清；(3)加入100μl包含50mmol/L葡萄糖、5mmol/L三羟甲基氨基甲烷Tris.HCl、1.0mmol/L乙二胺四乙酸的溶液Ⅰ，用振荡器彻底悬浮菌液；(4)加入200μl含有0.4mol/L NaOH、2%SDS的溶液Ⅱ，立即温和混匀，使细菌裂解，室温放置2min；(5)加入200μl含有5mol/L醋酸钾60mL、冰乙酸11.5mL、水28.5mL的溶液Ⅲ，立即上下颠倒离心管5-10次，使充分中和，室温放置，5min后，12000rpm离心5min；(6)将步骤(5)中的上请转移至收集管内的离心柱中，10000rpm室温离心1min；(7)弃废液，于离心柱中加入500μl的Wash Solution，12000rpm室温离心1min；(8)再重复步骤(7)；(9)取下离心柱，弃收集管中的废液，空管l2000rpm离心lmin；(10)弃废液，将离心柱置于新的灭菌1.5ml Ep管中，加入40μl Elution Buffer，50℃放置2min后，12000rpm室温离心1min。离心管中的溶液即为所抽提的质粒DNA；(11)琼脂糖凝胶电泳观察结果；pGEM-T/BmGAPDH、pGEM-T/BmCPI阳性重组克隆的鉴定：(1)PCR鉴定:pGEM-T/BmGAPDH PCR反应体系pGEM-T/BmCPI PCR反应体系反应体系在冰上调制，混匀，离心后置PCR仪，94℃预变性3min后，94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃再延伸7min，4℃冷却终止反应；扩增完毕后，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定；(2)酶切鉴定：取经PCR鉴定正确的重组质粒,用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切,建立25μl酶切体系，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段；双酶切反应体系取经PCR鉴定正确的重组质粒,用Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切,建立25μl酶切体系，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段；双酶切反应体系用封口膜封住开口，37℃水浴酶切4h，打开封口，继续加入体系；双酶切反应体系37℃水浴酶切4h,65℃灭活10min；经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定；(3)核酸序列测序鉴定：将含有pGEM-T/BmGAPDH、pGEM-T/BmGAPDH重组质粒的大肠杆菌的菌液测序；（五）pcDNA3.1(+)/BmGAPDH/BmCPI重组表达质粒构建与鉴定pcDNA3.1(+)/BmGAPDH/BmCPI重组质粒构建：(1)表达载体和目的片段的制备将重组质粒pGEM-T/BmGAPDH用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，重组质粒pGEM-T/BmCPI用Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切，表达载体pcDNA3.1(+)质粒用Xho Ⅰ和Nhe Ⅰ进行双酶切，酶切体系及条件同上，经过双酶切后的BmGAPDH片段、BmCPI片段及pcDNA3.1(+)片段分别经低溶点琼脂糖电泳后纯化回收；(2)表达载体和目的片段的连接配制一块琼脂糖凝胶，将刚刚回收的样品分别等量上样，紫外分光光度计检测所回收DNA的浓度，以便为下步的连接比例做参考，将上述三个回收片段以4:4:1比例进行连接；目的基因和载体的摩尔比为4:4:1，建立25μl连接体系：连接反应体系PCR仪16℃条件水浴下连接20h；(3)连接产物转化感受态DH5α菌连接转化方法同前，取连接液转化感受态大肠杆菌DH5α，涂布于LB-Amp(100mg/ml)平板上，37℃过夜培养；pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH重组质粒鉴定：(1)初步鉴定在转化平板上挑取数个单菌落进行摇菌培养，分别提取质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳，将明显大于空载体质粒的条带初步筛选为重组克隆株；(2)PCR鉴定以上述初步鉴定为阳性克隆的pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH重组质粒做为模板，分别用BmGAPDH、BmCPI的PCR反应体系进行PCR反应，PCR反应体系及条件与pGEM-T/BmGAPDH、pGEM-T/BmCPI阳性重组克隆的PCR鉴定相同，凡扩增出目的基因的即为阳性重组克隆。同时以空载体质粒为模板做阴性对照；(3)酶切鉴定取初步鉴定的重组质粒DNA进行双酶切，做三管，分别用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ，Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ以及Xho Ⅰ和Nhe Ⅰ进行双酶切反应，同时以相应质粒做对照。用1.0%低溶点琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段大小；双酶切反应体系取经PCR鉴定正确的重组质粒,用Xho Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切,建立25μl酶切体系，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段；双酶切反应体系用封口膜封住开口，37℃水浴酶切4h，打开封口，继续加入体系；双酶切反应体系取经PCR鉴定正确的重组质粒,用Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切,建立41μl酶切体系，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段；双酶切反应体系取经PCR鉴定正确的重组质粒,用Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切,建立40μl酶切体系，37℃水浴酶切6h,65℃灭活10min；用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段；（六）pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH重组质粒的大量抽提纯化(1)将含有重组质粒的菌种室温融化后取50ul加入到含有50ul100mg/ml Amp的100ml LB溶液中置于37℃恒温、250rpm的摇床培养12-16h，之后放置4度冰箱冷却；(2)菌液培养12-16h后，使用紫外分光光度计测定其OD600值，如果OD600数值在0.6-0.8之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，则可以用来进行质粒的抽提；(3)取过夜菌至50ml离心管内，5000rpm离心1分钟，收集沉淀，弃上清；(4)每管加入5ml质粒大量抽提试剂盒的悬浮液,重悬细胞沉淀；(5)之后每管加入5ml质粒大量抽提试剂盒的裂解液，颠倒离心管4-6次，室温放置3-5分钟，使细菌完全裂解，溶液透明；(6)每管加入5ml质粒大量抽提试剂盒的结合液，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生，然后5000rpm室温离心10-20分钟；(7)将上清倒入或吸入到质粒纯化柱内，室温离心2分钟，倒弃收集管内液体；(8)在质粒纯化柱内加入7ml质粒大量抽提试剂盒的洗涤液，室温离心2分钟，洗去杂质，倒弃收集管内液体，之后再5000rpm室温离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发；(9)将质粒纯化柱置于50ml离心管上，加入2ml质粒大量抽提试剂盒的洗脱液至管内柱面上，放置2分钟，然后5000rpm室温离心2分钟，所得液体中加入10ml DNA纯化结合液，混匀后加到原质粒纯化柱内；(10)再次室温离心2分钟后，倒弃收集管内液体；(11)在质粒纯化柱内加入15ml质粒大量抽提试剂盒的洗涤液，5000rpm室温离心2分钟，近一步洗去杂质后，倒弃收集管内液体；(12)5000rpm室温离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发；(13)将质粒纯化柱置于50ml离心管上，加入2ml洗脱液至管内柱面上，放置2分钟；(14)5000rpm室温离心2分钟，所得液体即为超纯质粒；(15)用生理盐水将纯化的质粒稀释至终浓度为1mg/mL，-20℃保存备用。