一种产胆盐水解酶的基因工程菌及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种产胆盐水解酶的基因工程菌及其筛构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明采用重组DNA技术将植物乳杆菌Lactobacillus plantarum BBE7的胆盐水解酶(bsh)基因克隆连接到大肠杆菌表达载体pET28a(+)，并转化Escherichia coli BL21(DE3)，经筛选鉴定得到一株可以产较高活性胆盐水解酶的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bsh，保藏编号为CCTCC NO：M 2011115。该菌株表达的胆盐水解酶对甘氨脱氧胆酸钠(GDCA)的总酶活为3.7819U/mL，比野生菌的总酶活提高了近11倍。这为胆盐水解酶的大规模生产以及其作为功能食品来降低血清胆固醇奠定了良好的基础。

主权项

一种发酵生产生产胆盐水解酶的方法，其特征在于：以产胆盐水解酶的基因工程菌为生产菌株，将20℃、200rpm条件下，种子培养基培养的种子培养到OD600在0.6‑0.7之间，以2%的接种量转入基本发酵培养基，于20℃、200rpm条件下培养；当菌体OD值为0.6，重组菌在20℃诱导35小时，IPTG浓度为1.0mM；所述种子和线面培养基为LB,1L LB的组成为：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g，用1N NaOH将pH调至7.0；斜面培养基添加琼脂15g；基本发酵培养基为TB培养基,1L TB的组成为：去离子水900mL，胰蛋白胨12g，酵母抽提物24g，甘油10mL，高压灭菌，冷却至60℃，加100mL灭菌磷酸钾缓冲液；所述基因工程菌于2011年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2011115，其构建方法为:1）设计引物以CCTCC NO：M2011116的基因组DNA为模板扩增出bsh基因；2）将bsh基因连接到大肠杆菌表达载体pET28a(+)，得到重组载体pET28a(+)‑bsh；3）重组载体转化Escherichia coli BL21(DE3)得到基因工程菌CCTCC NO：M2011115；所述引物如下：bsh1‑F：5’‑CGGGATCCATGTGTACTGCCATAACTTATCAATCTT‑3’bsh1‑R：5’‑CCCAAGCTTGTTAACTGCATAGTATTGTGCTTCTGAT‑3’。