获取miRNA候选靶基因的方法及其专用反转录引物

摘要

本发明公开了获取miRNA的候选靶基因的方法及其专用反转录引物。该方法包括：1）以带茎环结构和目的miRNA种子序列的DNA为反转录引物，获取与目的miRNA种子序列互补的mRNA对应的cDNA第一条链，得到A库；2）以带特异接头和14-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA为反转录引物，获取真核生物目的组织的mRNA对应的cDNA第一条链，得到B库；所述反转录引物B的结构是特异接头-T14-20；3）将所述A库和所述B库合成双链cDNA后进行杂交得到杂交DNA分子，扩增所述杂交DNA分子上所述目的miRNA种子序列和所述特异接头之间的DNA片段，根据所述扩增产物得到目的miRNA的候选靶基因。

主权项

获取miRNA候选靶基因的方法，包括：1）以名称为反转录引物A的带茎环结构和目的miRNA种子序列的DNA为反转录引物，对真核生物目的组织的mRNA进行反转录，该反转录记为反转录A，获取与所述目的miRNA种子序列互补的mRNA对应的cDNA第一条链，得到A库；所述反转录引物A的结构是茎环结构‑miR‑X，所述茎环结构满足如下条件：所述茎环结构的茎部序列完全配对，且CG含量为57%‑62%，环部不配对碱基数≤6个，且能值低于‑30.00kcal/mol；所述miR‑X是所述目的miRNA种子序列，是由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA，所述miR‑X的5′至3′方向是3′至5′方向单链DNA序列的反向序列：所述3′至5′方向单链DNA序列是将所述目的miRNA从3′至5′方向的倒数10个核糖核苷酸均替换为所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸得到的序列；所述核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是指腺嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧腺嘌呤核苷酸，鸟嘌呤核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧鸟嘌呤核苷酸，胞嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸相应的脱氧核糖核苷酸是脱氧胸腺嘧啶核苷酸；2）以名称为反转录引物B的带特异接头和14‑20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸的DNA为反转录引物，对所述真核生物目的组织的mRNA进行反转录，获取所述真核生物目的组织的mRNA对应的cDNA第一条链，得到B库；所述反转录引物B的结构是特异接头‑T14‑20，所述特异接头满足如下条件：所述特异接头的CG含量为50%～60%，所述特异接头和所述反转录引物A的茎环结构的序列最大配对碱基数≤5个，最大串联配对碱基数目小于≤4个；3）合成所述A库的cDNA第二条链得到双链cDNA，记为A′库；合成所述B库的cDNA第二条链得到B′库；将所述A′库和所述B′库进行杂交得到杂交DNA分子，以所述杂交DNA分子为模板用引物A1和引物B1扩增所述杂交DNA分子上所述引物A1和所述引物B1之间的DNA片段，收集所得到的扩增产物，根据所述扩增产物得到所述目的miRNA的候选靶基因；所述引物A1是选自所述反转录引物A的单链DNA，所述引物A1的序列由所述反转录引物A的茎环结构的环部序列和紧靠所述目的miRNA种子序列的一个茎部序列组成；所述引物B1的序列是所述反转录引物B的部分或全部特异接头序列的同向互补序列。