固相多肽合成曲普瑞林的制备方法

摘要

本发明公开了一种固相多肽合成曲普瑞林的制备方法，包括如下步骤：以.RinkAmide AM树脂或.Rink Amide MBHA树脂起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护十肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得粗品，粗品经C18(或C8)柱分离纯化，冻干后，制得曲普瑞林精品。本发明的方法，工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，收率高，质量稳定，生产成本低，接肽收率高，避免使用氟化氢等剧毒试剂，三废污染少，纯化收率高达25％以上，每步接肽收率均在98％以上；切肽后收率为：78.8％，总收率为：25.4％。

主权项

固相多肽合成曲普瑞林的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)以Rink Amide AM树脂或Rink Amide MBHA树脂起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护十肽树脂，其间依次脱去Fmoc‑保护基团，同步进行脱侧链保护基团； (2)切肽，获得粗品； (3)粗品经C18柱分离纯化，冻干后，制得曲普瑞林精品； 其特征在于，所说的依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护十肽树脂，其间依次脱去Fmoc‑保护基团的方法，包括如下步骤： (1)制备Fmoc‑Gly‑树脂： 取所说的树脂用DMF浸泡，使树脂溶胀，抽干，然后加入溶解于接肽试剂的Fmoc‑Gly‑OH、TBTU/HBTU和HOBt的混合物，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc‑Gly‑树脂；加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干； 所说的接肽试剂为：NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比，下同； 所说的脱帽试剂为：PIP∶DMF＝1∶2～5，体积比，下同； 混合物中： 树脂的重量体积浓度为5～20ml/g； TBTU/HBTU的摩尔数为树脂的2～6倍； HOBt的摩尔数为树脂的2～6倍； Fmoc‑Gly‑OH的摩尔数为树脂的2～6倍； 树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g； (2)制备Fmoc‑Pro‑Gly‑树脂： 在步骤(1)的Fmoc‑Gly‑树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，然后加入溶解于接肽试剂的Fmoc‑Pro‑OH、TBTU/HBTU、HOBT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc‑Pro‑Gly‑树脂；加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干； 所说的接肽试剂为：NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比； 所说的脱帽试剂为：PIP∶DMF＝1∶2～5，体积比； 混合物中： 树脂的重量体积浓度为5～20ml/g； TBTU/HBTU的摩尔数为树脂的2～6倍； HOBT的摩尔数为树脂的2～6倍； Fmoc‑Pro‑OH的摩尔数为树脂的2～6倍； 树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g； (3)制备Fmoc‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂： 在步骤(2)的Fmoc‑Pro‑Gly‑树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂； 混合物中： Fmoc‑Pro‑Gly‑树脂的重量体积浓度为5～20ml/g； TBTU/HBTU的摩尔数为树脂的2～6倍； HOBT摩尔数为树脂的2～6倍； Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH的摩尔数为树脂的2～6倍； Fmoc‑Pro‑Gly‑树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂； (4)制备Fmoc‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂 在步骤(3)的Fmoc‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc‑Leu‑OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反应0.5～1.5小时，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂； 混合物中： Fmoc‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂的重量体积浓度为5～20ml/g； Fmoc‑Leu‑OH的摩尔数为树脂的2～6倍； Fmoc‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；其余操作以及工艺条件同上； (5)制备Fmoc‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂： 在步骤(4)的Fmoc‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc‑D‑Trp‑OH、 TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反应0.5～1.5小时，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂； 混合物中： Fmoc‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂的重量体积浓度为5～20ml/g； Fmoc‑D‑Trp‑OH的摩尔数为树脂的2～6倍； Fmoc‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂； 其余操作以及工艺条件同上； (6)制备Fmoc‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂： 在步骤(5)的Fmoc‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反应0.5～1.5小时，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂； 混合物中： Fmoc‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂重量体积浓度为5～20ml/g； Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH的摩尔数为树脂的2～6倍； Fmoc‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂； 其余操作以及工艺条件同上； (7)制备Fmoc‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂： 在步骤(6)的Fmoc‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂； 混合物中： Fmoc‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂重量体积浓度为5～20ml/g； Fmoc‑Ser(tBu)‑OH的摩尔数为树脂的2～6倍； Fmoc‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂； 其余操作以及工艺条件同上； (8)制备Fmoc‑Trp‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂： 在步骤(7)的Fmoc‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc‑Trp‑OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc‑Trp‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂； 混合物中： Fmoc‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂重量体积浓度为5～20ml/g； Fmoc‑Trp‑OH的摩尔数为树脂的2～6倍； Fmoc‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂； 其余操作以及工艺条件同上； (9)制备Fmoc‑His(Trt)‑Trp‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂： 在步骤(8)的Fmoc‑Trp‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc‑His(Trt)‑OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc‑His(Trt)‑Trp‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂； 混合物中： Fmoc‑Trp‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂重量体积浓度为5～20ml/g； Fmoc‑His(Trt)‑OH的摩尔数为树脂的2～6倍； Fmoc‑Trp‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂； 其余操作以及工艺条件同上； (10)制备pGlu‑His(Trt)‑Trp‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂： 在步骤(9)的Fmoc‑His(Trt)‑Trp‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，加入用接肽试剂溶解的pGlu‑OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得pGlu‑His(Trt)‑Trp‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂； 混合物中： Fmoc‑His(Trt)‑Trp‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂重量体积浓度为5～20ml/g； pGlu‑OH的摩尔数为树脂的2～6倍； Fmoc‑His(Trt)‑Trp‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂； 其余操作以及工艺条件同上； 将获得的pGlu‑His(Trt)‑Trp‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑D‑Trp‑Leu‑Arg(Pbf)‑Pro‑Gly‑树脂，加入预冷至0～10℃的切肽试剂中，反应，收集切肽后的粗品； 所说的切肽试剂为： TFA/EDT/H2O/TIS＝680ml/18ml/18ml/3.6ml； 将曲普瑞林粗品溶于乙酸中，过滤，滤液经C18柱纯化，流速为100‑650ml/min；检测波长为：280nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后去盐，冻干，获得成品，总收率25.4，以树脂的60mmol计； 流动相为：0.1M醋酸铵∶乙腈＝7.5∶2.5；体积比； 乙酸的重量浓度为0.5～10％，乙酸中曲普瑞林粗品的重量浓度为1～50％，脱帽反应温度为10～60℃，反应时间为5～30分钟，接肽反应温度为10～60℃，反应时间为0.5～1.5小时，切肽温度为10～60℃，时间为1～6小时。