一种重组可溶性hSHH-N蛋白的制备方法

摘要

本发明公开了一种重组可溶性hSHH-N蛋白的制备方法。该方法是以SEQIDNO:1~2为引物扩增出hSHH-N基因，再连接到载体pET43.1a(+)构建重组表达载体，转化大肠杆菌，IPTG诱导其产生重组可溶性hSHH-N融合蛋白，融合蛋白经肠激酶酶切，除去Nus-tag蛋白标签后，再经过镍柱纯化、超滤、透析，最后冻干得到所需重组可溶性hSHH-N蛋白。本发明的制备方法步骤简单，成本低，制备的可溶性hSHH-N蛋白具有诱导骨形成活性，具有较好的市场前景。

主权项

一种重组可溶性hSHH‑N蛋白的制备方法，其特征在于步骤如下：（1）以SEQ ID NO:1~2为引物，GenBank登录号NM_000193.2的序列为模板，进行PCR扩增反应，PCR条件是94℃，5min，94℃，30s，57℃，1min，72℃，30s，35个循环，72℃，10min；（2）PCR产物与载体pET43.1a(+)用限制性内切酶EcoR I，Xho I进行双酶切，连接构建重组质粒，转化大肠杆菌，在LB培养基上37℃条件下培养，构建重组hSHH‑N基因工程菌；（3）培养重组hSHH‑N基因工程菌，IPTG诱导其产生重组可溶性hSHH‑N融合蛋白；（4）步骤（3）重组hSHH‑N基因工程菌进行破碎细胞、分离、收集融合蛋白；（5）融合蛋白经透析除去咪唑，加入肠激酶，25℃酶切过夜，再经过镍柱纯化，得到初步纯化的重组可溶性hSHH‑N蛋白；（6）初步纯化的重组可溶性hSHH‑N蛋白经过超滤、透析、冻干得到所述重组可溶性hSHH‑N蛋白；其中，步骤（5）肠激酶加入量为每200μg 融合蛋白加入4U；步骤（5）镍柱纯化是采用亲和柱层析纯化，填料为Ni‑NTA树脂，吸附条件为pH值5.5~8.5之间；洗脱过程中洗脱液pH值在4~6范围内逐渐降低的同时，咪唑浓度在0.02~0.5M范围内逐渐提高或加入 EDTA或者EGTA；步骤（6）中超滤是采用分子量为10000道尔顿的超滤膜超滤，透析是采用半透膜，透析液含有0.1%（质量百分浓度）的醋酸。