一种机体保护多肽(BPC 157肽)的制备方法

摘要

本发明公开了一种合成机体保护多肽(BPC 157肽)的方法，包括以三苯氯甲基树脂、4-甲基-三苯氯甲基树脂、4-甲氧基-三苯氯甲基树脂、2-氯-三苯氯甲基树脂或王树脂中的任何一种为起始原料，用DIC/HOBt或DIC/HOAt或BOP/HOBt或BOP/HOAt或HBTU/HOBt或HBTU/HOAt或HATU/HOBt或HATU/HOAt或HCTU/HOBt中的一种为缩合剂进行接肽反应，获得保护机体保护多肽(BPC 157肽)树脂，其后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得BPC 157粗品，再经C18(或C8)柱分离纯化，冷冻干燥后，制得机体保护多肽(BPC 157肽)纯品。该方法可用微波辐射以加快反应速度，缩短多肽合成周期，降低生产成本。本发明的方法制备的机体保护多肽(BPC 157肽)，具有原辅材料来源方便，工艺稳定，接肽收率高，质量可控，收率高，纯度高，生产成本低，周期短，可规模化生产等诸多优点，完全满足机体保护多肽(BPC 157肽)的应用要求。

主权项

制备BPC157肽的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)制备Fmoe‑Val‑WangResin称取王氏树脂1g；Loading：1.0mmol／g，倒入反应柱中，加入10mlDMF，常温浸泡30分钟后用真空泵抽干，加入Fmoc‑Val‑OH 3.4g，DIC0.7ml，DMAP0.1g，DMF10ml，于常温反应2小时，再加入封闭试剂苯甲酰氯0.6ml, 吡啶0.4ml, DCM10ml常温反应0.5小时，树脂用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Val‑WangResin；       (2)制备Fmoc‑Leu‑Val‑WangResin    在步骤(1)的Fmoe‑Val‑WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑Leu‑OH 0.7g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Leu‑Val‑WangResin；   (3)制备Fmoc‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin    在步骤(2)的Fmoc‑Leu‑Val‑WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑ Gly‑OH0.7g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin；    (4)制备Fmoc‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin   在步骤(3)的Fmoc‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑Ala‑OH0.7g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin；    (5)制备Fmoc‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin   在步骤(4)的Fmoc‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑ Asp(otBu)‑OH1.2g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin； (6)制备Fmoc‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin在步骤(5)的Fmoc‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑Asp(otBu)‑OH1.1g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin；(7)制备Fmoc‑ Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin在步骤(6)的Fmoc‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑Ala‑OH0.7g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin；(8)制备Fmoc‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin在步骤(7)的Fmoc‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑Pro‑OH0.8g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin；(9)制备Fmoc‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin在步骤(8)的Fmoc‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑ Lys(Boc)‑OH1.1g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin；(10)制备Fmoc‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin在步骤(9)的Fmoc‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑Gly‑OH0.7g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin； (11)制备Fmoc‑Pro‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin在步骤(10)的Fmoc‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑Pro‑OH0.8g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Pro‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin； (12)制备Fmoc‑Pro‑Pro‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin在步骤(11)的Fmoc‑Pro‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑Pro‑OH0.8g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Pro‑Pro‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin； (13)制备Fmoc‑Pro‑Pro‑Pro‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin在步骤(12)的Fmoc‑Pro‑Pro‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑Pro‑OH0.8g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Pro‑Pro‑Pro‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin；(14)制备Fmoc‑Glu(otBu)‑Pro‑Pro‑Pro‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin在步骤(13)的Fmoc‑Pro‑Pro‑Pro‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑ Glu(otBu)‑OH1.1g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Glu(otBu)‑Pro‑Pro‑Pro‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin； (15)制备Fmoc‑Gly‑Glu(otBu)‑Pro‑Pro‑Pro‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin在步骤(14)的Fmoc‑Glu(otBu)‑Pro‑Pro‑Pro‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑ Gly ‑OH0.8g，DIEA0.4ml，TBTU0.56g，HOBT0.2g，DMF10ml常温反应1.5小时，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤3次，DMF洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Gly‑Glu(otBu)‑Pro‑Pro‑Pro‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin；(16) 制备Gly‑Glu(otBu)‑Pro‑Pro‑Pro‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin在步骤(15)的Fmoc‑Gly‑Glu(otBu)‑Pro‑Pro‑Pro‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin中，加入脱帽试剂，即20%哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂常温反应20分钟，用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，用甲醇浸泡1小时，抽干，用氮气吹干树脂成干燥的颗粒，所得到的树脂为：Gly‑Glu(otBu)‑Pro‑Pro‑Pro‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin；(17)制备粗品把吹干的Gly‑Glu(otBu)‑Pro‑Pro‑Pro‑Gly‑Lys(Boc)‑Pro‑Ala‑Asp(otBu)‑Asp(otBu)‑Ala‑Gly‑Leu‑Val‑WangResin倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷的切肽试剂，即TFA9.5ml，H2O0. 5ml，常温反应1.5小时，过滤除去树脂，加冰乙醚500ml沉淀，3500转3分钟离心收集沉淀物，用乙醚洗涤3次，用纯水溶解后，低温冷冻干燥24小时，获得BPC157肽粗品；（18）纯化将步骤（17）的BPC157肽粗品1.23g溶于13ml水中，过滤，滤液上样于C18色谱柱，即 Kromasil‑C18，20mm *250mm，流动相为如下A、B液体的混合物：A：0.1%三氟乙酸加99.9%水；B：0.1%三氟乙酸加99.9%乙腈；从A液体占混合物比例100%开始梯度洗脱，期间B液体占混合物比例逐渐升高，直至占100%，流速为10ml／min，检测波长为： 215nm；用相同条件下以实验室级别生产的少量纯品做对照指示目标峰，收集目标峰的流出液，浓缩冻干，获得成品。