一种用于氯霉素快速检测的直接包被ELISA方法

摘要

本发明公开了一种氯霉素的快速检测方法，属于检验技术领域，本发明利用戊二醛对聚苯乙烯微孔板进行处理，在微孔板表面产生带有醛基基团的网络结构，通过醛基与氨基化氯霉素的氨基反应，从而将氨基化小分子半抗原直接偶联到微孔板表面，基于氨基化小分子半抗原直接偶联技术以及生物素-链霉亲和素放大系统建立了一种新型的氯霉素快速检测ELISA。该方法不仅可以避免小分子半抗原与大分子蛋白偶联的繁琐过程，而且其灵敏度比传统ELISA灵敏度提高了近20倍。氨基化小分子半抗原直接偶联ELISA方法在农药、兽药残留的检测应用中具有很大的潜力，可以用于快速检测试剂盒的研制。

主权项

一种用于氯霉素快速检测直接包被ELISA方法，具体步骤如下(1)氨基化氯霉素的合成称取氯霉素64.6mg溶于700μL无水乙醇中，缓慢加入29.2mg锌粉，磁力搅拌器上加热反应40min；反应结束后12000rpm/min离心5min除去不溶物；采用液液萃取法对氨基化氯霉素进行纯化；(2)氨基化氯霉素的直接偶联微孔板使用0.01mol L‑1，pH9.6碳酸盐缓冲液将戊二醛(GA)稀释成6％，加入到中度吸附微孔板中，每孔200μL，37℃孵育2h；洗涤液(PBST)洗涤3次；用PBS缓冲液(80mmol L‑1，pH8.0)将25nM氨基化氯霉素稀释成适当浓度加入到微孔板中，37℃孵育2h；PBST洗涤后，加0.5％氨基乙酸溶液，37℃孵育1h；洗涤后干燥保存；(3)直接包被ELISA方法的建立在偶联好氨基化氯霉素的酶标板中，加入用含0.1％BSA的PBS稀释的50μL生物素化一抗和一系列浓度(0，0.02，0.1，1，10，25，50，100ng mL‑1)的氯霉素，37℃孵育1.5h，PBST洗涤四次后，每孔加入100μL SA‑HRP，37℃孵育45min；PBST洗涤6次，每孔加100μL底物显色液，37℃孵育10min后每孔中加50μL 2mol L‑1H2SO4终止反应后，用酶标仪进行读数。