РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pmiR-EGFP, КОДИРУЮЩАЯ МИКРОPHK 302a, 302b, 302c, 302d И 367 КЛАСТЕРА 302/367 МЫШИ И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК EGFP, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ

摘要

1. Рекомбинантная плазмида pmiR-EGFP, кодирующая микроРНК 302a, 302b,302c, 302d и 367 кластера 302/367 мыши и флуоресцентный белок EGFP, предназначенная для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека и животных на основе плазмидного вектора pcDNA3.1/Hygro (-), включающая введение фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидные последовательности микроРНК 302a, 302b, 302c, 302d и 367 кластера 302/367 мыши размером 714 п.н., встроенного в полилинкер плазмиды pcDNA3.1/Hygro (-) по сайтуI, и фрагмента ДНК, содержащего CMV-EGFP-SV40 pA, размером 1634 п.н., встроенного по сайтуI, образуя два химерных сайтаI/I иII; общий размер плазмиды pmiR-EGFP составляет 8014 п.н., наличие конститутивного промотора CMV (P CMV) обеспечивает транскрипцию кластера 302/367, фрагмент CMV-EGFP-SV40 pA экспрессирует флуоресцентный белок EGFP генетической конструкции плазмиды pmiR-EGFP.2. Способ конструирования плазмиды pmiR-EGFP по п.1, где после выделениягеномной ДНК синтез фрагмента ДНК, содержащего последовательности микроРНК 302a, 302b, 302c, 302d и 367 кластера 302/367 мыши, осуществляют с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами: прямым miR302/367-F-XhoI 5'-CCGCCTCGAGGCTTATGTCTGTAACCGGGTC-3' и обратным miR302/367-R-MluI 5'-CTAGACGCGTTGAGAGTGCTGTCCAAGTAAG-3'; фрагмент ДНК размером 714 п.н., содержащий кластер микроРНК302/367, клонируют с помощью набора реагентов pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) и штаммаXL-10 Gold; клоны плазмиды pGEM-T Easy со встройками pGEM-miR последовательности выделяют и определяют нуклеотидную последовательность встройки в плазмиде pGEM-miR с помощью секвенирования; нуклеотидная последовательность показана на фиг.1.3. Способ конструирования плазмиды pmiR-EGFP по п.1, где встройку,содержащую кластер микроРНК 302/367, вырезают из плазмиды pGEM-miR с помощью эндонуклеазы рестрикцииI и лигируют