一种桔霉素免疫亲和柱的制备方法

摘要

本发明公开了一种桔霉素免疫亲和柱的制备方法，属于免疫亲和层析及生物毒素检测技术领域。公开了桔霉素免疫亲和柱的制备方法。采用甲醛缩合法将桔霉素与载体蛋白连接制备免疫原，免疫动物得到抗桔霉素抗体。采用本体聚合法制备嵌合铜离子聚合物。将聚合物吸附抗桔霉素抗体制得的免疫亲和吸附剂填充于固相萃取管中制得桔霉素免疫亲和柱。本发明制备的免疫亲和柱能与桔霉素特异性结合，净化富集得到纯度和浓度均较高的桔霉素溶液。免疫亲和柱最大结合容量为597ng；样品中桔霉素添加回收率为83.7％～93.2％；重复使用3次，回收率不低于80％。本发明可以应用于发酵食品中桔霉素的快速检测。

主权项

一种桔霉素免疫亲和柱的制备方法，其特征在于制备方法步骤如下：(1)免疫原的制备将10.0～40.0mg载体蛋白溶于2.5～10.0mL0.1mmolL‑1，pH5的乙酸钠溶液中配制得到载体蛋白‑乙酸钠溶液，将1.0～4.0mg桔霉素溶于0.2～0.8mL甲醇中配制得到桔霉素‑甲醇溶液，将桔霉素‑甲醇溶液和320～1280mL37％体积比的甲醛‑水溶液加入上述载体蛋白‑乙酸钠溶液中，37℃放置24小时，混合物于4℃用pH7.4，0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液透析三天；(2)抗桔霉素抗体的制备与纯化1.5～6.0mL免疫原加入适量生理盐水及等量福氏完全或不完全佐剂，首次免疫采用福氏完全佐剂，后续免疫均用福氏不完全佐剂，乳化，采用背部皮下注射与腿部肌肉注射相结合的方法，每隔两周免疫一次，共免疫6次，分别于第三、四、五、六次免疫一周之后由大白兔耳缘静脉处取血，将取得的血液离心处理后，得到抗血清，间接酶联免疫方法测定抗血清效价，效价达到要求时处死兔子，取全部抗血清，抗血清用蛋白A‑琼脂糖凝胶4B柱纯化后得到抗桔霉素抗体；(3)嵌合铜离子聚合物的制备采用本体聚合法制备嵌合铜离子聚合物，步骤为：0.3～1.2g单体和15～60mg铜化合物溶于4.0～16.0mL乙腈，4℃放置3小时后，加入10.0～40.0mmol交联剂和0.12～0.48mmol偶氮二异丁腈作为引发剂，超声脱气15分钟，充入氮气10分钟，封口，58℃恒温水浴引发，避光保护聚合，聚合物真空干燥1天后，用研磨器研磨，筛选35‑75μm颗粒，制备得到嵌合铜离子聚合物；(4)免疫亲和吸附剂的制备称取50～200mg嵌合铜离子聚合物放入圆底烧瓶，相继加入1～4mL纯水和1～4mL，9.2～36.8mg抗桔霉素抗体，25℃振荡吸附4～16小时，制备得到免疫亲和吸附剂；(5)免疫亲和柱的制备将免疫亲和吸附剂填充入固相萃取管中，加入pH7.4，0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液后自然沉淀，用pH7.4，0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗涤后，保 存于含0.02％体积比的叠氮钠的pH7.4，0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液中，制成桔霉素免疫亲和柱，于4℃保存待用即可。