一种提取梨花粉管细胞核的方法

摘要

本发明公开了一种提取梨花粉管细胞核的方法，包括以下步骤：1)采集花粉：采集大蕾期花药，干燥；2)花粉培养；3)细胞核的释放：单细胞筛研磨和双细胞筛过滤释放细胞核；4)细胞核纯化：采用Percoll密度梯度离心；5)清洗Percoll。该方法不涉及酶解提取原生质体，及传统研磨过滤技术。该方法具有操作简便、快捷、成本低、提纯效果明显等优点。提纯后的细胞核几乎没有细胞质部分污染，不仅可以应用DNA纤维制备，还可以应用于细胞核蛋白质组学研究，对于研究梨花粉管生长代谢及自交不亲和反应具有重要的意义。

主权项

一种提取梨花粉管细胞核的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：1）采集花粉：采集大蕾期花药，干燥；2）花粉培养：分离干燥花药中的花粉，将其加入到花粉培养基中，避光条件下，25～28℃，140~180 rpm，培养3~4 h；3）细胞核的释放：将培养好的花粉连同培养基倒入孔径为50 μm的细胞筛a内，并使培养基通过细胞筛流出，迅速在细胞筛a底部加一个孔径为40 μm的细胞筛b，将两个细胞筛放置于比其直径稍大的培养皿上，迅速将细胞核研磨液加入到细胞筛a中，用玻璃研棒以60～100 rpm速度研磨，同时再次添加细胞核研磨液使释放的细胞核不断流出经细胞筛b过滤到培养皿中，以上操作均在4℃下进行；4）细胞核纯化：将步骤3）所述培养皿中得到的液体加入到离心管中，在漩涡仪上微震动20～40 秒，迅速在4℃下200 g离心5 min得上清即为粗细胞核；将上清液转移到Percoll密度梯度工作液顶部在4℃下3500 g离心25 min；离心后，Percoll 密度梯度工作液顶部为淡黄色的细胞质，底部沉淀为纯化的细胞核；5）Percoll的去除：将纯化的细胞核悬浮于细胞核研磨液进行洗涤，并迅速在4℃下3500 g离心25 min；沉淀即为纯化后去除Percoll的梨花粉管细胞核，用研磨液悬浮备用；上述的细胞核研磨液配方为：0.3 M蔗糖，10 mM NaCl，10 mM MES ，5 mM EDTA，0.2 mM精胺，0.5mM亚精胺，0.2 mM PMSF，5 mM DTT，0.2%（v/v）Triton‑X‑100，以NaOH调整pH至6.0；上述Percoll 密度梯度工作液的配方为：将percoll 溶于10 mM  pH为6.0的MES‑NaOH缓冲液中制成28.5%（v/v）的percoll溶液，所述pH为6.0的MES‑NaOH缓冲液中包含0.25 M蔗糖，10 mM NaCl，3 mM EDTA，0.2 mM PMSF，3 mM DTT。