一种提高动物繁殖力的干扰载体

摘要

本发明公开了一种提高动物繁殖力的干扰载体，其序列包含基因序列Sequnence NO.11。本发明针对绵羊干扰素INHA基因的核苷酸序列设计合成多对miRNA单链寡核苷酸，构建了pMD-18T载体，通过功能性实验筛选，得到了抑制效果较强的MR062-3-R(Sequnence NO.6)载体，该载体包含基因序列Sequnence NO.11，进一步将基因序列Sequnence NO.11构建到miRNA慢病毒干扰载体。本发明还公开了上述新型载体的应用。

主权项

一种提高绵羊繁殖力的干扰载体，其特征在于，所述干扰载体为miRNA慢病毒干扰载体，通过以下方法制备： 1)将序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的一对合成好的oligo用ddH2O溶解成100μM，互补单链各取5μl混合，进行退火，然后将oligo混合物在95℃加热5分钟，然后放置室温自然冷却20分钟，形成双链oligo，将退火的双链oligo继续稀释成10nM浓度，用载体构建试剂盒BLOCK‑iTTM Pol II miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP，将上述得到的双链oligo插入到miRNA表达载体pcDNATM6.2‑GW/EmGFPmiR中，室温连接30分钟，并转化至感受态细胞DH5α，在每个转化平板中分别挑取3个克隆进行测序，验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的oligo序列一致； 2)使用Invitrogen公司的BP重组系统：2μl第1)步得到的含有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的miRNA表达载体pcDNATM6.2‑GW/EmGFPmiR、1μlpDONR221载体、2μlBP克隆酶II、5μl超纯水组成的BP重组反应体系，25℃反应1小时；然后加入1μl的蛋白酶K，37℃反应10分钟；取5μl重组反应液转化100μl的DH5α感受态细胞，选阳性克隆并测序验证，保留测序验证正确的BP重组质粒，从而将miRNA表达序列重组到载体pDONR221上，使用Invitrogen公司的LR重组系统：1μl BP重组产生的BP重组质粒、1μlpLenti6.3/V5‑DEST、2μl LR克隆酶II、6μl超纯水组成的LR重组反应体系，25℃反应1小时；然后加入1μl的蛋白酶K，37℃反应10分钟；取5μl重组反应液转化100μl的Stb13感受态细胞，选阳性克隆并测序验证，保留测序验证正确的BP重组质粒，从而得到含有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的单链寡核苷酸对的慢病毒载体pLenti6.3/V5‑DEST。