一种表达定向进化L-乳酸脱氢酶的工程菌及应用

摘要

本发明公开了一种表达定向进化L-乳酸脱氢酶的工程菌，是一种能够外源表达定向进化的烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(NAD)非依赖型L-乳酸脱氢酶的工程大肠杆菌；其是以商业大肠杆菌C43(DE3)为基础，通过转入含有突变NAD(烟酰胺腺嘌呤双核苷酸)非依赖性L-乳酸脱氢酶基因的表达载体pETDuet-1-mlldD，使其能够高表达相应的突变蛋白，具有S-扁桃酸降解活性。本发明还公开了所述工程菌在拆分外消旋扁桃酸中的应用，是以所构建工程菌完整细胞作为催化剂进行外消旋扁桃酸的拆分，同时生产手性纯R-扁桃酸以及苯乙酮酸，具有底物利用率高、产物浓度高、光学纯度高以及后提取简便等优点。

主权项

一种表达定向进化L‑乳酸脱氢酶的工程菌，其特征在于：所述工程菌是一种能够外源表达定向进化的烟酰胺腺嘌呤双核苷酸（NAD）非依赖型L‑乳酸脱氢酶的工程大肠杆菌，由如下方法构建获得： （1）设计并合成PCR引物，自施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）CCTCC No.M206010菌株的基因组中扩增L‑iLDH的基因lldD；其中所述引物是： 上游引物lldU：AAGCTTATGATCATTTCCGCCTCTACC， 下游引物lldD：CTCGAGTCAGACGTCAGCAGACGTTG； （2）选取L‑iLDH基因lldD中的108位的缬氨酸作为目标位点，设计并合成含有突变位点的PCR引物，通过PCR反应，将lldD基因第323的胸腺嘧啶核苷酸（T）改变为胞嘧啶核苷酸（C），即相应于将蛋白质序列108位的缬氨酸（Val）突变为丙氨酸（Ala），得到突变L‑iLDH基因mlldD；其中所述引物是： 上游引物lmU：TTCACCCTTTCCACCGCGTCGGTCT， 下游引物lmD：GGGAATCCCTTTCTTGTCTGCCGC； （3）以含有T7启动子和氨苄青霉素抗性的大肠杆菌宿主适用表达载体pETDuet‑1出发，将突变L‑iLDH基因mlldD序列通过T4DNA连接酶连接至表达载体，构建表达载体pETDuet‑1‑mlldD； （4）使用化学转化的方法将表达载体pETDuet‑1‑mlldD转化至大肠杆菌C43（DE3）所制备的感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有氨苄青霉素抗性的固体LB培养基上，筛选得到含有连接突变L‑iLDH基因表达载体的转化子，即得到表达突变蛋白的烟酰胺腺嘌呤双核苷酸（NAD）非依赖型L‑乳酸脱氢酶的工程大肠杆菌。