基于CE-SSCP的血液病原菌快速检测方法

摘要

本发明公开了一种基于CE-SSCP的血液病原菌快速检测方法，针对血液感染的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌的16SrRNA基因的保守区域，设计相应的PCR通用引物并荧光标记，然后采用PCR反应对血液样本中的病原菌进行扩增以及电泳检测，本检测方法所设计的通用引物长度与扩增跨度适宜，与待测血液样本中病原菌模板DNA的互补程度高，使得扩增产物的特异性好，对于不同菌株的同一类细菌皆有良好适用性，本方法重复性好，灵敏度高，能够检测痕量的病原菌基因组DNA，非常适合在临床上广泛应用。

主权项

一种非诊断目的的基于CE‑SSCP的血液病原菌快速检测方法，其特征在于：包括如下步骤：a.针对待测病原菌16SrRNA基因的保守区域设计通用引物并荧光标记；所述病原菌包括：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌；所述通用引物序列为：上游引物：5’‑TGGCGGCGTGCCTAATACATG‑3’下游引物：5’‑CCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTC‑3’；b.提取待测血液样本细菌基因组DNA以该基因组DNA为模板采用步骤a所得通用引物进行PCR扩增，所得扩增产物进行CE‑SSCP分析，得到待测血液样本的CE‑SSCP电泳图；所述PCR扩增的循环参数为：94℃预变性5min；94℃变性40s，58℃退火45s，72℃延伸40s，共30个循环；72℃终延伸5min，结束PCR扩增；所述CE‑SSCP分析所用筛分介质为POP‑7或CAP胶，CE‑SSCP分析过程中的电泳参数为：进样电压15.0KV，电泳电压13.0KV，电泳温度35℃；c.将所得待测血液样本的CE‑SSCP电泳图与七种病原菌标准菌株的CE‑SSCP电泳图进行比对，根据不同病原菌的出峰时间不同检测血液感染病原菌。