新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法

摘要

本发明涉及中药类水溶性蛋白分子量的检测领域，具体是涉及一种新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法。本发明新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法，运用分子生物学和指纹图谱的原理与技术，将先进的生物技术与指纹图谱新思路相结合，运用SDS-PAGE电泳技术，对新风胶囊中水溶性蛋白成分分析，为今后建立该制剂电泳特征图谱提供依据。通过实验可知，新风胶囊水溶性蛋白共分离出成分深浅不一的35条蛋白带，蛋白质大小在12.5kDa～200kDa范围内均有分布，其中主带有2条，其分子量分别为16.38kDa、17.07kDa左右，这2条主带，可作为新风胶囊水溶性蛋白成分特征指标。

主权项

新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：①、试剂的配制电极缓冲液，称取甘氨酸5.0g、三羟甲基氨基甲烷3.0g，十二烷基磺酸钠1.0g，加适量双蒸水溶解后，用1mol/l盐酸调pH至8.3，然后加双蒸水至1000ml，置于4℃保存；固定液，称取三氯醋酸5.0g，加双蒸水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加双蒸水至500ml；考马斯亮蓝脱色液，量取乙醇400ml、冰醋酸100ml与双蒸水500ml，混匀；1％琼脂糖溶液，称取琼脂糖0.2g，加电极缓冲液20ml，加热溶解成澄清溶液；10％过硫酸铵溶液，称取过硫酸铵0.1g，加1ml双蒸水溶解至澄清；②、供试品溶液的制备取新风胶囊内容物5.0g，于研钵中研成细粉，加6ml 1M Tris‑HCl缓冲液溶解，研匀，静置5min，4000r/min离心20min，吸取上清液900μl，加300μl 4×蛋白质上样缓冲液混合，沸水浴5min，以12000r/min离心20min，冷却后吸取上清液分装，每管分装20μl，‑20℃贮存；③、电泳槽的安装电泳槽的各部件在组装前均需清洗干净，选择水平操作台面，首先将白色内芯放入黑色内槽中，然后将电泳玻璃采取凹形玻璃板在白色内芯内侧、矩形玻璃板在白色内芯外侧的方向，顺着白色内芯一侧的胶条小心放入内芯；当两侧的玻璃全部放入到白色内芯后，确认凹、平板的底部边缘均与黑色 内槽密封槽平齐，旋紧紧固旋钮；用移液枪吸取1％琼脂糖溶液，沿密封槽一端灌入封闭玻璃板，为防止留存气泡，稍抬起一端赶去气泡，琼脂糖溶液需进入胶室0.9～1.1cm，凝固5～7min后进行灌胶操作；④、凝胶的制备按4ml 1.5M Tris‑HCl缓冲液、6.7ml 30％丙烯酰胺、1.6ml 1％十二烷基磺酸钠、0.1ml 10％四甲基乙二胺、0.1ml 10％过硫酸铵和3.3ml双蒸水配制12.5％分离胶溶液，然后开始灌胶，并防止气泡产生，水封室温下聚合；待分离胶溶液聚合后，用滤纸吸取上面的水层，再灌入4.5％浓缩胶溶液，并插上样品梳，4.5％浓缩胶溶液按1.35ml 30％丙烯酰胺、0.9ml 1％十二烷基磺酸钠、0.07ml 10％四甲基乙二胺、0.07ml 10％过硫酸铵、2.25ml 1M Tris‑HCl缓冲液和4.33ml双蒸水配制；⑤、上样与电泳待浓缩胶溶液聚合后，双手轻取出梳子，提住白色把手将黑色内槽放入外槽中，用微量注射器吸取样品提取液5μl，缓缓注入加样孔中，动作要轻，不能破坏胶面；在黑色内槽内部和外部分别加注电极缓冲液，内部液面高度要高过凹板下沿10mm，外部液面高度为外槽的1/3；盖上安全盖，接通电泳仪，80v电压1小时后，待溴酚蓝示踪指示剂前沿到达分离胶上沿时，把电压调至100v，待示踪指示剂行至距琼脂层0.9～1.1cm时，关闭电源，停止电泳，整个电泳过程需要3～4个小时；⑥、染色与脱色电泳结束后，打开电泳槽，取出凝胶，切去浓缩胶，保留分离胶并标记溴 酚蓝前沿，置固定液中固定半小时后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床上缓慢摇动，室温染色1.5～2.5小时；倒出染色液，加入适量考马斯亮蓝脱色液，确保考马斯亮蓝脱色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床上缓慢摇动，室温脱色3.5～4.5小时；更换考马斯亮蓝脱色液2～4次，直至蓝色背景全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期，完成脱色后，把凝胶保存在含20％甘油的水中，进行拍照；对拍射照片进行光密度积分值分析；⑦、蛋白质分子量的测定根据样品迁移距离/指示剂迁移距离计算相对迁移率，以标准蛋白质分子量对数对其相对迁移率作标准曲线，根据待测样品相对迁移率查该曲线，计算其分子量。