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一种小鼠毛囊干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法，其特征在于按照如下步骤操作：第一步，分离小鼠触须部毛囊：用手术镊子将出生后7天小鼠毛囊从触须部皮肤上取下，转移至磷酸盐缓冲液pH7.0+10%胎牛血清的操作液中清洗，并去除与毛囊连接在一起的皮脂腺、立毛肌、脂肪，在新鲜细胞培养液DMEM/F‑12中将毛囊清洗；第二步，体外培养毛囊干细胞：毛囊经DMEM/F‑12洗完后，置于0.25% Trypsin‑0.04%EDTA，37℃消化10分钟，轻轻吹打混匀后加入10%血清终止消化，于DMEM/F12中清洗，过400目细胞筛后转入毛囊干细胞培养液培养，以培养当天为零代，每4天传代一次；第三步，毛囊干细胞体外形成拟胚体EB：当毛囊干细胞培养到第二代又3‑4天时，离心收集细胞，弃上清，加入0.25% Trypsin室温消化5分钟，然后轻轻吹打至单细胞，终止消化，Medium 199洗两遍后转入24孔板悬浮培养，置于EB培养基中培养；第四步，小鼠成纤维细胞培养及饲养层细胞的制作：将怀孕13.5天的母鼠杀死取出胎鼠，取出头、四肢、内脏、尾将躯干转移至磷酸盐缓冲液清洗，置于0.25% Trypsin‑0.04%EDTA，37℃消化10分钟，轻轻吹打混匀后，加入10%胎牛血清终止，转入成纤维细胞培养基中培养，以培养当天为零代，细胞达90%汇合度时传代；取1‑3代成纤维细胞，倒掉培养基，加入含有10μg丝裂霉素C的成纤维细胞培养液，置于培养箱中1.5‑2小时，取出用磷酸盐缓冲液清洗，用0.25%Trypsin将贴壁的成纤维细胞消化下来，终止后DMEM高糖清洗，转入24孔板贴壁培养；第五步，EB培养后与饲养层共培养向原始生殖细胞PGC分化：用0.25% Trypsin消化EB,室温消化过程中用枪吹打至单细胞，用血清终止消化，收集细胞，离心；弃上清，加入PGC培养液悬浮细胞，将细胞稀释到细胞浓度为5×104个/ml PGCs培养液里；向铺有小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的24孔中加入0.5ml重悬的细胞，将培养板置于37℃、饱和湿度、5%CO2中培养；培养液包括：DMEM高糖,10%胎牛血清，0.23mM丙酮酸钠，0.1mM Non‑Essential Amino Acids，2mM L‑谷氨酰胺，0.1mM β‑巯基乙醇,20ng/ml表皮生长因子,40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子,40ng/ml干细胞生长因子。 |
