污水处理厂聚磷菌实时荧光定量PCR检测方法

摘要

一种污水处理厂聚磷菌实时荧光定量PCR检测方法，属于污水生物处理技术领域。本发明以实际生活污水富集的聚磷菌作为标准品来源，菌群进化分支丰富。采用针对聚磷菌的关键功能基因——聚合磷酸盐激酶基因的特异性引物，获得了Ⅰ、ⅡA、ⅡB、ⅡC和ⅡD5个主要进化分支的标准品，并采用通用性好、成本较低的SYBR Green荧光染料法建立了5个主要进化分支的实时荧光定量PCR标准曲线。5条标准曲线的相关系数分别为1.000，0.998，0.999，0.999，0.998。扩增效率在90%到110%之间。利用建立的标准曲线对某污水处理系统中聚磷菌的不同进化分支进行定量检测。本发明经济、简便、可靠。

主权项

1.一种污水处理厂聚磷菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：提取实际生活污水富集的聚磷菌的基因组DNA，采用聚磷菌5个分支的聚合磷酸盐激酶基因引物，先采用温度梯度PCR后进行琼脂糖凝胶电泳检测，确定不同进化分支的复性温度；再采用常规PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检验后，切胶纯化回收DNA扩增片段，获得I、ⅡA、ⅡB、ⅡC和ⅡD5个分支的扩增片段；将5个分支的扩增片段与载体连接，连接好的载体导入感受态细胞培养12-16h，挑取白斑进行重组菌落PCR验证；提取包含目的片段的质粒用作实时荧光定量PCR的标准品，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，建立标准曲线；利用建立的标准曲线对污水处理厂中聚磷菌进行定量检测；上述温度梯度PCR和常规PCR扩增体系及反应条件如下：常规PCR扩增程序如下：95℃变性10min；25-35个循环反应，每个循环包括95℃40s，A℃1min，72℃2min；最后72℃延伸5min；其中复性温度A由梯度PCR确定，不同分支的最佳复性温度如下：聚磷菌分支        I分支      ⅡA分支      ⅡB分支      ⅡC分支     IID分支最佳复性温度A     61℃       58℃         61℃         66℃        63℃上述琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖质量百分比浓度为2%，电泳电压为120V，电泳时间为60min；上述实时荧光定量PCR扩增反应体系及反应条件为：聚磷菌分支Ⅰ、ⅡA、ⅡB和ⅡC的实时荧光定量PCR反应采用三步法，在复性和延伸阶段检测和报告荧光，扩增程序如下：95℃变性3min；30-55个循环反应，每个循环包括94℃ 30s，A℃ 45s；最后72℃延伸30s；复性温度A℃与常规PCR复性温度相同；分支IID的实时荧光定量PCR反应采用四步法，扩增程序如下：95℃变性3min；30-55个循环反应，每个循环包括94℃ 30s，63℃ 45s，72℃ 30s，84℃5s；其中荧光信号检测温度为84℃。