应用腺病毒载体介导RNA干扰技术沉默固醇调控元件结合蛋白基因1的方法

摘要

本发明公开了一种应用腺病毒载体介导RNA干扰技术沉默固醇调控元件结合蛋白基因1的方法，该方法包括以下步骤：A1，克隆秦川牛固醇调控元件结合蛋白1基因（SREBP1）；A2，psiCHECK-Ⅱ-SREBP1表达载体的构建；A3，靶向SREBP1基因shRNA的设计、合成；A4，pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA表达载体的构建；A5，shRNA干扰效率的测定、筛选；A6，重组腺病毒载体的构建；A7，腺病毒包装、扩增、滴度测定；为应用RNA干扰技术研究秦川牛SREBP1基因的功能提供一种有效的方法。

主权项

1.一种应用腺病毒载体介导RNA干扰技术沉默固醇调控元件结合蛋白基因1的方法，其特征在于，包括以下步骤：A1步骤，克隆秦川牛固醇调控元件结合蛋白1基因（SREBP1）；A2步骤，psiCHECK-Ⅱ-SREBP1表达载体的构建；A3步骤，靶向SREBP1基因shRNA的设计、合成；A4步骤，pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA表达载体的构建；A5步骤，shRNA干扰效率的测定、筛选；A6步骤，重组腺病毒载体的构建；A7步骤，腺病毒包装、扩增、滴度测定；其中：所述A1步骤包括：步骤A11，设计、合成PCR扩增引物，具体执行以下操作：根据GenBank收录的牛的SREBP1基因序列（Accession NO.NM_001113302）用Primer5.0软件设计PCR扩增引物，在上游引物加PmeI酶切位点，下游引物加NotI酶切位点，引物序列如下：SREBP1-PmeI-F：AGCTTTgtttaaacTGACTGCGCCATGGACGAGC；SREBP1-NotI-R：AAGGAAAAAAgcggccgcTGATACGGAGACC；其中引物序列中的小写字母为外加酶切位点；步骤A12，PCR扩增SREBP1基因，具体执行以下操作：用KOD-Plus-Ver.2高保真聚合酶PCR扩增SREBP1基因，PCR反应体系为：cDNA模板1.2μl，上下游引物各0.6μl，25mM MgSO₄1.2μl，2Mm dNTP2μl，10×PCR Buffer2μl，ddH₂O12μl，KOD-Plus-（1U/μl）1μl，总反应体系20μl；PCR反应条件为：95℃，3min；95℃，30s，66℃，30s，72℃，210s，共33个循环；72℃，5min；取3μl PCR产物电泳检测并胶回收，-20℃保存备用；步骤A13，PCR产物与19-T Simple Vector连接，具体执行以下操作：取回收产物5μl，加入1μl普通Taq聚合酶混合物（MIX），72℃条件下，加“A”反应10min，将加“A”产物与19-T Simple Vector16℃于过夜连接，转化感受态E.coliDH5α，挑取单克隆菌落扩繁，取5ml菌液提取质粒用PmeI和NotI双酶切鉴定。