一种新型高效的蛋白酶活性检测方法

摘要

一种新型高效的蛋白酶活性检测方法，其特征在于：事先建立所需检测的蛋白酶活性与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关关系；再根据所需检测的蛋白酶的种类，设计一段含有该蛋白酶特异性切割位点的多肽底物；根据蛋白酶的最适温度和最适pH，投入未知浓度的蛋白酶含量，对相同量的多肽底物进行酶切反应；向多肽底物的酶切产物中投入相同量的合成量子点的前驱体，并在适宜温度下反应以生成量子点；反应结束后，测定合成的量子点的荧光光谱，然后将未知浓度的蛋白酶的酶切产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度与所述相关关系进行比对，即可获得该未知浓度的蛋白酶活性。本发明的方法方便快捷、灵敏度高、成本低，具有普遍适用性。

主权项

一种新型高效的蛋白酶活性检测方法，其特征在于：第一部分：事先建立所需检测的蛋白酶活性与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关关系，所述相关关系的建立由下列步骤组成：第一步，针对所需检测的蛋白酶的种类，设计一段含有该蛋白酶特异性切割位点的多肽底物；所述蛋白酶的种类是指具有特异性切割位点的胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、胶原酶、基质金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶中的任意一种；所述多肽底物中包含一段由2~10个氨基酸构成的肽链，所述肽链中含有能够被所述蛋白酶特异性切割的肽键以及两个带有巯基基团的半胱氨酸，其中，肽链的两端分别是一个带有巯基基团的半胱氨酸；第二步，在第一步的基础上，在所需检测的蛋白酶的最适温度以及最适pH值条件下，向多组相同量的多肽底物中各投入已知浓度的蛋白酶，各组已知浓度的蛋白酶之间具有浓度梯度，然后进行酶切反应，得到各组酶切产物，其中，多组已知浓度的蛋白酶中的最高浓度为所述多肽底物摩尔浓度的0.5%~10 %，设定的每一组酶切反应的时间相同并且小于或等于最高浓度的蛋白酶100%酶切多肽底物的时间；投入的所述多肽底物中含有的巯基基团的摩尔浓度在0.5 ~10mmol/L之间；第三步，向所述各组酶切产物中投入相同量的用于合成量子点的具有金属离子和非金属离子的前驱体，并在25~100℃下反应0.5~1小时，各组反应结束后生成量子点，其中，投入的所述前驱体中金属离子的摩尔浓度为所述多肽底物中含有的巯基基团的摩尔浓度的85~120%，非金属离子的摩尔浓度为金属离子摩尔浓度的20 %~100 %；所述金属离子的前驱体选自镉化合物、铅化合物、银化合物、锌化合物、铟化合物、汞化合物、铜化合物、锰化合物中的任意一种或任意两种，所述非金属离子的前驱体选自含硫化合物、含硒化合物、含碲化合物、含磷化合物、含砷化合物中的任意一种或任意两种；但任意两种金属离子的前驱体与任意两种非金属离子的前驱体不同时应用于一个合成量子点的反应；所述量子点是二元量子点，具体为碲化镉、硒化镉、硫化镉、硫化铅、硒化铅、硫化银、硒化银、硫化锌、硒化锌、碲化锌、磷化镉、砷化镉、磷化铟、砷化铟中的任意一种，或者所述量子点是三元量子点，具体为镉汞碲、镉汞硒、镉汞硫、锌汞碲、锌汞硒、锌汞硫、锌镉碲、锌镉硒、锌镉硫，锌碲硒，锌碲硫、锌硒硫、镉碲硒、镉碲硫、镉硒硫、锌铜硒、锌锰硒、铜铟硫、铜铟硒中的任意一种；第四步，对第三步中各组生成的量子点进行荧光光谱测定，得到所述量子点的荧光光谱波峰强度，再根据所需检测的多组蛋白酶的已知浓度，最终得到蛋白浓度与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关关系，即蛋白酶活性与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关关系；第二部分：针对胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、胶原酶、基质金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶中的任意一种，蛋白酶活性检测方法由以下步骤组成：第一步，设计多肽底物针对被检测的蛋白酶种类，设计一段与所述第一部分的第一步中相同的多肽底物；第二步，进行酶切反应设计好多肽底物后，在被检测的蛋白酶的最适温度以及最适pH值条件下，向多肽底物中投入未知浓度的被检测蛋白酶，然后进行酶切反应，得到酶切产物；其中，酶切反应的时间与所述第一部分的第二步中酶切反应时间相同，所述多肽底物的量与所述第一部分的第二步中多肽底物的量相同；第三步，合成量子点向第二步中的酶切产物中投入用于合成量子点的所述第一部分的第三步中的前驱体，并在与所述第一部分的第三步中相同的温度以及时间条件下反应，结束后生成量子点，其中，投入的所述前驱体中金属离子和非金属离子的量与所述第一部分的第三步中前驱体中金属离子和非金属离子的量相同；第四步，获得被检测的未知浓度的蛋白酶的活性对第三步中生成的量子点进行荧光光谱测定，得到该量子点的荧光光谱波峰强度，再将该荧光光谱波峰强度与所述第一部分中得到的相关关系进行比对，最终获得被检测的未知浓度的蛋白酶活性。