发明名称 |
一种油菜种子携带油菜黑胫病病原菌的分子检测方法 |
摘要 |
本发明公开了一种可有效检测油菜籽携带油菜黑胫病病原菌的DNA提取及检测方法,其特征在于,包括以下步骤:1)带菌种子的制备;2)取相同数量的带菌种子提取DNA,用RAPD检测经不同处理所得带菌种子的DNA质量;3)从不同带菌率的油菜种子中提取目的病原菌DNA;4)DNA的微量提取;5)模板浓度梯度检测;6)不同带菌率带菌种子DNA的提取;7)PCR扩增不同带菌率带菌种子的DNA。该方法的精确度达到2‰准确率。 |
申请公布号 |
CN103131778A |
申请公布日期 |
2013.06.05 |
申请号 |
CN201310057533.9 |
申请日期 |
2013.02.05 |
申请人 |
内蒙古农牧业科学院 |
发明人 |
李子钦;宋培玲;皇甫海燕;郝丽芬;赵存虎 |
分类号 |
C12Q1/68(2006.01)I;C12Q1/04(2006.01)I;C12R1/645(2006.01)N |
主分类号 |
C12Q1/68(2006.01)I |
代理机构 |
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代理人 |
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主权项 |
一种油菜种子携带油菜黑胫病病原菌的分子检测方法,其特征在于,包括以下步骤:1)带菌种子的制备:用高压灭菌、经1%NaCLO表面消毒及未经任何处理的种子制备不同带菌率的带菌种子;2)取相同数量的带菌种子提取DNA,用RAPD检测经不同处理所得带菌种子的DNA质量;3)DNA大量提取:从不同带菌率的油菜种子中用CTAB法提取目的病原菌DNA;4)DNA微量提取:取100ul经CTAB法大量提取后所得DNA再用QIAGEN试剂盒进行微量提取;5)模板浓度梯度检测:50ul的扩增体系中加10ul模板较理想;6)扩增反应体系:采用ITS引物对病菌rDNA的ITS片段进行扩增,引物序列为:ITS1(5′‑CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA‑3′)和ITS2(5′‑GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG‑3′),50uL PCR反应体系为,5uL 10×PCR buffer,0.2mM dNTP,ITS1和ITS2引物各1μM,0.1UTaq酶,10uL模板DNA,17.5uL ddH2O,PCR反应程序为:94℃,2min;94℃,30s;58℃,30s;72℃,1min;44个循环;72℃,5min;8℃5min;7)不同带菌率带菌种子DNA的提取:先用步骤3)的提取方法然后再用步骤4)的提取方法;8)PCR检测不同带菌率带菌种子DNA。 |
地址 |
010031 内蒙古自治区呼和浩特市玉泉区昭君路22号 |