一种海洋微生物来源的低温β―半乳糖苷酶及其编码基因与应用

摘要

本发明涉及海洋生物技术领域。本发明提供了一种海洋微生物来源的低温β―半乳糖苷酶，是对本申请人早前从东海海域的海水中培养分离得到的一株海洋盐单胞菌（Halomonas sp.）菌株P6009-1（保藏号为CCTCC No:M2011001）发酵培养纯化制备得到的，该酶在0℃时催化乳糖水解的能力为最高活性的20%，体现出良好的低温特性。本发明还进一步提供了该β―半乳糖苷酶的编码基因，以及该β-半乳糖苷酶在分解牛奶乳糖中的应用。

主权项

一种海洋微生物来源的低温β‑半乳糖苷酶，其特征在于，该酶是用以下方法制备得到的： （A）Halomonas sp.P6009‑1的发酵 将Halomonas sp.P6009‑1菌种（保藏号为CCTCC No:M2011001）接种于Zobell2216E液体培养基，28℃，130rpm摇床振荡培养24h进行活化，取500μL活化好的菌液接种于100mL的含2%乳糖的Zobell2216E培养基中，28℃，130rpm振荡培养4d； 所述的Zobell2216E液体培养基配方为：蛋白胨5g，酵母粉1g，磷酸铁0.1g，溶于1L人工海水，pH7.4；所述的人工海水的配方为：NaCl25.0g，Na2SO44.0g，KCl0.7g，NaHCO30.20g，KBr0.10g，H3BO30.03g，NaF0.003g，53mL1.0mol/L MgCl2溶液，10mL1.0mol/l CaCl2溶液，0.90ml0.1mol/L SrCl2溶液，蒸馏水1000ml； （B）粗酶液的制备 发酵结束后，发酵液离心取菌体，将菌体重悬于磷酸缓冲液，冰浴条件下用超声波粉碎机破碎细胞，破菌后的菌液离心取上清为粗酶液； （C）低温β‑半乳糖苷酶的纯化 将步骤（B）所得到的粗酶液10ml，加入2.2g的(NH4)2SO4进行盐析。离心取上清再加入0.6g的(NH4)2SO4进行第二次盐析，离心取沉淀。加入3mL的含1mmol/L MgCl2、pH7.2的0.1mol/L K2HPO4‑KH2PO4重悬沉淀，HiPrep TM26/10脱盐柱除盐，收集目的蛋白；进一步取2mL上样于PABTG亲和柱，用15%的含0.5mol/L KCl、0.1mol/L乳糖、1mmol/L MgCl2、pH7.2的0.1mol/LK2HPO4‑KH2PO4的buffer B缓冲液洗脱60min，接着用20%的buffer B缓冲液洗脱20min，流速为1mL/min；将经亲和层析纯化后浓缩、置换缓冲液后的活性组分上样2mL于Capto DEAE弱阴离子交换柱，用0%~100%的含1mol/LKCl,1mmol/L MgCl2,pH7.2的0.1mol/LK2HPO4‑KH2PO4的buffer C缓冲液梯度洗脱40min，流速为1mL/min，检测波长为280nm和214nm；活性组分再经Capto Q强阴离子交换柱、Sepharcryl S200分子筛进一步分离后，获得电泳纯的P6009‑BGalH，分别进行SDS‑PAGE和非变性‑PAGE，发现其分子量约为90kDa，亚基大小为48kDa左右。