荧光定量PCR检测醋醅中醋酸菌和乳酸菌的方法

摘要

本发明提供一种对醋醅微生物群落中醋酸菌、乳酸菌属进行定量分析的方法，具有较高的特异性和灵敏度，能快速准确的对复杂群落中特定种属的微生物进行定量。

主权项

一种荧光定量PCR检测醋醅中醋酸菌和乳酸菌的方法，其特征是，具体步骤如下：①设计、合成针对于醋酸菌属和乳酸菌属的特异性引物；②对分离纯化得到的葡萄糖醋酸杆菌(Gluco nacetobacter sp.)和戊糖乳酸菌(Lactobacillus pentosus)进行摇瓶培养，利用细菌提取试剂盒分别对二者的培养液进行DNA提取；③分别以葡萄糖醋酸杆菌(Gluco nacetobacter sp.)和戊糖乳酸菌(Lactobacillus pentosus)的DNA为模板，以Ace‑F/AceR和Lac‑F/Lac‑R为引物进行PCR扩增，获得目的片段，并将PCR产物割胶回收；④构建重组质粒，将目的片段与pMD19‑T Vector连接，连接后转化JM109大肠杆菌感受态细胞，挑取转化子扩大培养，提取质粒，并用PCR验证目的片段是否插入pMD19‑TVector，验证成功的质粒作为荧光定量PCR的标准样品；⑤利用液氮研磨、酶消化和高盐提取结合的方法提取发酵过程中不同时间点醋醅群落的总DNA作为待测样品；⑥确立荧光定量PCR反应体系和反应条件；⑦重组质粒倍比稀释8个梯度，与待测样品同时进行荧光定量PCR，根据标准样品的拷贝数与CT值建立标准曲线，然后通过标准曲线和待测样品的CT值对醋酸发酵过程不同时间醋醅群落中醋酸菌和乳酸菌进行定量分析。