| 摘要 |
Test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanych czastek polistyrenowych sprzezonych z fosforylowanymi nukleotydami do identyfikacji lekoopornosci szczepów bakteryjnych, sklada sie z membrany nitrocelulozowej typu Lateral Flow nasaczonej punktowo roztworem bialka wiazacego biotyne w ilosci od 0,005 mg/mm2 do 0,1 mg/mm2 zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu oraz reagenta detekcyjnego zawierajacego 25 ?g aminosilanizowanych nanoczastek magnetycznych sprzezonych kowalencyjnie z fosforylowana sonda hybrydyzacyjna w ilosci 1-10 nmoli w obecnosci karbodiimidu i 1-metyloimidizolu oraz z 1-10 pmolami sondy hybrydyzacyjnej znakowanej biotyna. Sposób wytwarzania testu diagnostycznego na bazie amino modyfikowanych czastek polistyrenowych sprzezonych z fosforylowanymi nukleotydami do identyfikacji lekoopornosci szczepów bakteryjnych polega na tym, ze w pierwszym etapie membrane nitrocelulozowa typu Lateral Flow nasacza sie punktowo roztworem bialka wiazacego biotyne w ilosci od 0,005 mg/mm2 do 0,1 mg/mm2 zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu, w drugim etapie prowadzi sie inkubacje amino modyfikowanych nanoczastek polistyrenowych o stezeniu 25 ?g/ml z sonda hybrydyzacyjna z wolna grupa fosforanowa zawierajaca od 1 do 10 nmoli oligonukleotydu, po zakonczeniu sprzegania powstale nanoczastki poddaje sie koncentracji poprzez odwirowanie przez 5 min. przy przyspieszeniu 14400 x g, odrzuca sie supernatant a osad zawiesza sie w 100 ?l -200 ?l dejonizowanej wody destylowanej, nastepnie roztwór ponownie poddaje sie koncentracji, osad nanoczastek magnetycznych zawiesza sie w 39 -109 ?l dejonizowanej wody destylowanej i dodaje sie 1 ?l roztworu biotynylowanej sondy hybrydyzacyjnej zawierajacej 1 -10 pmoli oligonukleotydu, po czym w trzecim etapie do 10 -30 ?l reagenta detekcyjnego dodaje sie 10 ?l gestej hodowli bakteryjnej, mieszanine reakcyjna umieszcza sie w lazni wodnej w temperaturze 90 -100°C w czasie 3 -5 min, nastepnie pozostawia sie do ostygniecia do temperatury pokojowej i 10 -20 ?l mieszaniny reakcyjnej przenosi sie na membrane z immobilizowanym bialkiem wiazacym biotyne. |
