双标记核酸恒温扩增方法及检测试纸条

摘要

本发明公开一种双标记核酸恒温扩增方法及试纸条，该方法通过先合成内引物、外引物和环引物，用生物素和荧光素标记内引物或/和环引物，将标记引物加入LAMP反应体系中恒温扩增，得到双标记的核酸恒温扩增产物。试纸条包括支撑层、核酸扩增产物吸附层，核酸扩增产物吸附层粘贴于支撑层上，以生物素亲和蛋白及异硫氰酸荧光素抗体分别在纤维素层上印制检测印迹和对照印迹。本发明的试纸条检测特异性强、灵敏度高、速度快，既能直观检测LAMP扩增产物，又能克服胶体金检测试纸特异性相对较低的缺点，可广泛用于各种致病性微生物或病原体中特异性基因的检测。

主权项

1.一种食品中沙门氏菌特异性基因invA的扩增方法，其特征在于，所述扩增方法包括以下步骤：（1）引物设计及标记：通过查阅文献和用 BLAST 软件分析筛选出沙门氏菌特异性基因invA序列，针对该片段设计出LAMP 引物并合成，引物设计通过LAMP专用引物设计软件完成，得到如下引物：正向外引物 F3－invA  5’- CTGGGCGTTTTTTTGTCCTG -3’，反向外引物 B3－invA  5’- GGGAAGGTTAAGGAGGGTGA -3’，正向内引物 FIP－invA  5’- GCGAGGTTTGGCGGCTGATA- TTTTTCGCGACGACAAAATCTGG -3’，反向内引物 BIP－invA  5’- AACTTTAGCGCAAGGTGCCTC- TTTTTGCCGGTAAACTACACGATGA -3’，正向环引物LF－invA  5’- AGGCTTCGCGTACAGAGG -3’，反向环引物LB－invA  5’- CACGTCAGCAAAGCGTACC -3’，用生物素和异硫氰酸荧光素分别标记内引物FIP和BIP的5’端；（2）反应总体积为 25μl，反应体系如下：核酸模板用量2.0 μl；F3－invA母液浓度为20 μM，用量1.0 μl，终浓度0.8 μM；B3－invA母液浓度为20 μM，用量1.0 μl，终浓度0.8 μM；FIP－invA母液浓度为40 μM，用量1.0 μl，终浓度1.6 μM；BIP－invA母液浓度为40 μM，用量1.0 μl，终浓度1.6 μM；LF－invA母液浓度为5 μM，用量1.0 μl，终浓度0.2 μM；LB－invA母液浓度为5 μM，用量1.0 μl，终浓度0.2 μM；甜菜碱母液浓度为5 M，用量5.0 μl，终浓度1.0 M；dNTP母液浓度为150 mM，用量3.0 μl，终浓度1.2 mM；MgSO₄母液浓度为100 mM，用量0.5 μl，终浓度4.0 mM；Bst DNA Polymerase Buffer母液浓度为10×，用量2.5 μl； Bst DNA Polymerase母液浓度为8 U/μl，用量1.0 μl，终浓度0.32 U/μl；ddH₂O用量5.0 μl；（3）扩增反应：在温度为 60℃ 的恒温水浴锅保温20分钟；                   （4）产物检查：将固定有生物素亲和蛋白avidin的试纸条插入到上述反应体系中，层析5分钟，荧光灯下检测，检测线位置显示绿色荧光“”印迹，表示样品中含有沙门氏菌特异性基因invA，所述试纸条包括支撑层、吸附层，支撑层为不吸水薄片条，吸附层粘贴于支撑层上，所述吸附层从测试端依次为测试端纤维层、纤维素膜层和手柄端吸水材料层，用生物素亲和蛋白及异硫氰酸荧光素抗体分别在纤维素膜层上印制检测印迹和对照印迹，检测印迹和对照印迹平行排列为为“”，所述测试端吸附纤维层、吸水材料层上均覆盖有保护膜，在测试端纤维层的保护膜上印制有样品保护线；所述不吸水薄片条为硬质塑料片条，所述纤维素膜层是用硝酸纤维素膜制成，所述手柄端吸水材料层是用吸水纸制成，所述测试端纤维层是用玻璃棉制成。