半乳糖化季铵化壳聚糖的超氧化物歧化酶结合物及其制备

摘要

半乳糖化季铵化壳聚糖的超氧化物歧化酶结合物及其制备，由SOD分子上的自由氨基结合半乳糖化的季铵化壳聚糖构成，其中：所述结合半乳糖化的季铵化壳聚糖的SOD分子上的自由氨基的修饰率是15.22%～43.13%；且一个SOD分子可以结合1～8个半乳糖化的季铵化壳聚糖分子。本发明的SOD结合物与天然SOD相比，不仅保留了SOD原有的分解超氧阴离子的作用，而且可以显著提高SOD的等电点，并能借助结合物分子中的半乳糖与细胞表面的半乳糖受体结合，增强对细胞的结合能力，集SOD的抗自由基作用与壳聚糖的抗炎、抗纤维化以及抗多种自由基于一体，且具有抗原性低、半衰期长、稳定性高等特性，能够更充分发挥其抑制活性氧自由基的作用，便于其在临床上的应用。

主权项

半乳糖化季铵化壳聚糖的超氧化物歧化酶结合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）壳聚糖的季铵化修饰取低分子量壳聚糖，加入KI、20%的NaOH，并加入二甲基亚砜溶解，60℃下水浴加热20 min，然后加入碘甲烷，搅拌回流1～3 h，然后加入五倍体积的无水乙醇，4 ℃放置过夜，离心洗涤得沉淀，将沉淀用适量的蒸馏水溶解，用Dowex阴离子交换树脂柱进行离子交换，收集样品峰，并及时用稀盐酸将收集得到的样品调至中性；（2）季铵化壳聚糖的半乳糖化修饰将季铵化壳聚糖和乳糖加入到蒸馏水中，搅拌使其溶解，加入甲醇，室温，连续搅拌反应24～36h，滴加10%的KBH4水溶液，室温搅拌 3～6 d，反应液过滤，置于截留分子量为10 000的透析袋中对蒸馏水透析24 h，滤去水不溶物，滤液冷冻干燥，得近白色粉末状固体即为半乳糖化季铵化壳聚糖； 上述乳糖按照季铵化壳聚糖与乳糖以重量比为1﹕2～4的量加入；上述甲醇按照季铵化壳聚糖与甲醇以mg比mL计，以1﹕40～60的量加入；上述KBH4水溶液按照季铵化壳聚糖与10%的KBH4水溶液以mg比mL计，以1﹕2.5～5的量加入；（3）精确称取超氧化物歧化酶（SOD） 以及相当于SOD 5～6倍重量的半乳糖化季铵化壳聚糖，分别溶于NaH2PO4‑Na2HPO4缓冲液中，然后将半乳糖化季铵化壳聚糖溶液缓慢加入到SOD溶液中，在25℃缓慢搅拌反应，于30min和1h分别加入相当于SOD 0.5～1倍重量的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC.HCl），反应一定时间后，置于TX004纤维素透析袋中用Tris‑HCl缓冲液4℃暗处透析，以终止修饰反应；（4）透析完毕后透析内液用4.5µm的微孔滤膜过滤，上离子交换层析，检测波长为254nm；梯度洗脱，收集并置于TX004纤维素透析袋中用PEG 20 000 4℃包埋浓缩，后用PD‑3‑9纤维素透析袋用双蒸水4℃透析，冷冻干燥，制得半乳糖化季铵化壳聚糖的超氧化物歧化酶结合物纯品；（5）对产物进行鉴定；制备得到半乳糖化季铵化壳聚糖的超氧化物歧化酶结合物由SOD分子上的自由氨基结合半乳糖修饰的季铵化壳聚糖构成，结合半乳糖化季铵化壳聚糖的SOD分子上的自由氨基的修饰率是15.22%～43.13%；所述半乳糖化季铵化壳聚糖分子量为2000～5000道尔顿；所述季铵化壳聚糖的季铵度为24.0%～33.0%；所述半乳糖化季铵化壳聚糖的半乳糖化修饰率为20.0%～25.0%。