一种检测乙肝病毒YMDD耐药突变的方法

摘要

本发明提供了一种检测乙肝病毒YMDD耐药突变的方法，该方法利用RT-ARMS-qPCR方法检测乙肝病毒YMDD耐药突变。本发明采用序列特异性引物和荧光染料SYBRGreenⅠ进行扩增，实现了反应的实时监测，缩短检测时间，简化了操作步骤，而且不需要扩增后的分析过程，减少了产物污染的可能，与Taqman探针需双标记方法比较，SYBRGreenⅠ不需要设计合成荧光探针，简化了设计思路，成本较低。并结合熔解曲线分析，具有反应的特异性。

主权项

一种制备检测乙肝病毒YMDD耐药突变的标准曲线的方法，其特征在于：利用RT‑ARMS‑qPCR方法制备检测乙肝病毒YMDD耐药突变的标准曲线；所述RT‑ARMS‑qPCR方法为：根据乙型肝炎病毒基因序列的YMDD区域设计ARMS引物；分别构建野生型和突变型质粒；以SYBR Green 为荧光检测信号，在ARMS引物的存在下，以构建的质粒为标准品，建立标准曲线，再对野生型YMDD和突变型YVDD模板进行定量；所述引物为：共同引物KF：5'‑TCA TMT TCC TCT KCA TCC TGC‑3'野生型下游引物MR：5'‑CCC AAW ACC AVA TMA TCC AT‑3'突变型下游引物VR：5'‑CCC AAW ACC AVA TMA TCC GC‑3'；其中M代表A或C；K代表G或T；W代表A或T；V代表G或A或C；所述RT‑ARMS‑qPCR的反应体系和反应条件为：采用25μL的反应体系，2倍浓缩的SYBR Premix Ex Taq 12.5μL，引物对20μM各0.4μL，50倍浓缩的ROX Reference Dye 0.5μL，HBV DNA模板2μL，dH2O 9.2μL；于ABI7000荧光PCR仪进行反应并检测，PCR反应条件：95℃ 30s，然后按95℃ 5s，61℃ 31s，进行40个循环，荧光检测在60℃。