稳定转化家蚕细胞株滴定BmNPV法及报告基因构建法

摘要

本发明公开了一种报告基因转化载体的构建方法，包括构建报告基因转移载体；PCR合成含多角体启动子及多聚腺苷酸加尾序列的报告基因表达盒；获得报告基因转化载体。本发明还同时公开了一种利用报告基因稳定转化家蚕细胞株测定家蚕BmNPV病毒滴度的方法，包括如下步骤：1）细胞培养；2）病毒样品的制备；3）病毒接种：在步骤1）所得的家蚕稳转细胞中加入步骤2）所得的梯度稀释后的病毒样品进行培养；4）统计细胞感染率；5）计算病毒滴度。本发明的方法便于肉眼通过普通荧光显微镜直接观察，无需借助昂贵的特定仪器，可在接种病毒后3~4天内测定病毒滴度，从而实现BmNPV病毒滴度的快速测定。

主权项

报告基因转化载体的构建方法，其特征是包括如下步骤： 1）、构建报告基因转移载体；2）、PCR合成含多角体启动子及多聚腺苷酸加尾序列的报告基因表达盒；以报告基因转移载体为模板，扩增上游为多角体启动子（Polyhedrin Promoter, Ppolh）下游为多聚腺苷酸加尾序列（PolyA）的报告基因表达盒；3）、获得报告基因转化载体：通过双酶切转化载体pIZT/V5‑His制备OpIE2启动子（OpIE2 promoter）和OpIE2多聚腺苷酸加尾序列（OpIE2 polyadenylation sequence）两个元件之外的转化载体；在T4 DNA连接酶的作用下，将步骤2）所得的报告基因表达盒PCR产物经同样双酶切后连接到所述转化载体中，筛选鉴定克隆有报告基因表达盒的重组转化载体。