一种高活性蚓激酶的制备方法

摘要

本发明公开了一种高活性蚓激酶的制备方法，其包括以下步骤：(1)将蚯蚓洗净，加入磷酸盐缓冲液，捣碎，过滤取滤液，再离心，取上清液；(2)超滤，得到粗酶液；(3)硫酸铵分级沉淀，用磷酸盐缓冲液溶解沉淀，得到酶液；(4)将酶液上Sephadex G-25柱纯化；(5)再上DEAE-纤维素柱纯化，得到高活性蚓激酶。本发明以餐厨垃圾干粉喂养蚯蚓，再从蚯蚓中提取蚓激酶，实现了餐厨垃圾资源化利用和附加值的转移；对传统的酶分离纯化方法进行改进优化，提取纯化的蚓激酶比酶活达42000U/mg，达到制药用酶的要求；本发明方法具有操作简便、成本低廉的特点，易于工业化放大生产。

主权项

一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将蚯蚓洗净，加入磷酸盐缓冲液，捣碎，过滤取滤液，得到蚯蚓粗蛋白溶液，再进行离心，取上清液；（2）将步骤（1）所得上清液进行超滤，得到粗酶液；（3）4℃下，向粗酶液中加入硫酸铵，使粗酶液中硫酸铵的饱和度达到20‑45%，静置3.5‑4h，然后离心，取上清液；往上清液中继续加入硫酸铵，使上清液中硫酸铵的饱和度增加到50‑75%，静置3.5‑4h，然后离心，收集沉淀，用磷酸盐缓冲液溶解沉淀，得到酶液；（4）将酶液上Sephadex G‑25柱，以磷酸盐缓冲液为洗脱液洗脱，自动部分收集器收集洗脱液，每管10ml，测定每管洗脱液的OD280nm值，计算每管洗脱液中的蛋白质含量，合并出现峰值的各管洗脱液；（5）将步骤（4）得到的洗脱液上DEAE‑纤维素柱，然后用0.1M的NaCl溶液进行淋洗，再用0.1‑0.6M的NaCl溶液进行梯度洗脱，自动部分收集器收集洗脱液，每管10ml，测定每管洗脱液的OD280nm值，计算每管洗脱液中的蛋白质含量，合并出现峰值的各管洗脱液，得到高活性蚓激酶；步骤（4）和（5）所述洗脱的流速为2ml/min；步骤（1）和（3）所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.8、浓度为100mmol/L，加入前在4℃预冷；步骤（2）所述超滤采用STM‑DGM多功能膜分离系统，工作温度：25‑28℃，料液pH值：7.8，压强：0.5‑0.7MPa，膜通量：9‑12L/(m2.h)，浓缩比：5.0:1‑5.2:1；步骤（4）所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.8、浓度为5mmol/L。