一种绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法

摘要

本发明公开了一种绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法。该方法采用自行设计的绵羊肺炎支原体热休克蛋白70（HSP70）基因序列的种属特异性引物，进行种属特异性PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳图谱分析，建立绵羊肺炎支原体的简便、快速、准确的定性检测方法。本发明可用于绵羊肺炎支原体的快速诊断，具有特异性强、重复性好、灵敏度高和易于标准化的优点。

主权项

一种绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法，其特征在于该方法的步骤如下：A. 模板DNA的制备（1）取100g组织进行匀浆，再把匀浆后的组织4000 r/m离心5min，取上清，上清11000r/m离心30min，弃上清；若是细菌培养物，则取1ml细菌培养物于1.5ml离心管中，11000r/m离心30min，弃上清；（2）取500µL STE悬浮沉淀，加入20µL 10% SDS、10µL 10mg/mL蛋白酶K，混匀后于56℃水浴消化1.5h；（3）加入与在步骤（2）得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合物，他们的体积比是25:24:1，混匀，10000r/m离心5min；（4）离心后步骤（3）获得的溶液分成上层水相、中间固相与下层有机相，吸取上层水相，加入与所述水相等体积的异戊醇‑氯仿混合物，混匀后10000r/m离心3min，取上清液；（5）往上述上清液中加入0.1倍体积的5mol/L NaCl和2倍体积的无水乙醇，混合均匀，10000r/m离心3min，得到DNA沉淀；（6）所述沉淀用70%（体积比）乙醇水溶液洗涤，10000r/m离心1min，弃乙醇，在室温下自然干燥，得到模板DNA，然后加入30µL灭菌去离子水溶解沉淀，于‑20℃保存备用；B. PCR扩增反应体系25µL： 10×PCR buffer 2.5µL，25mM Mg2+  1.5µL， 2.5mM dNTPs 2µL，10µM上下游引物各1µL， 5U/µL Taq酶 0.125µL，50ng/µL DNA模板 2µL，灭菌双蒸水补足至25µL；PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃终延伸10min，16℃结束反应；取5µL PCR产物使用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，并使用凝胶成像系统进行电泳图谱分析。