小鼠心肌祖细胞及其制备方法

摘要

本发明公开了一种小鼠心肌祖细胞及其制备方法，该心肌祖细胞表达心肌祖细胞标志物ISL1及心肌细胞系早期标志物Tbx5；其制备方法是先分离培养胚胎15.5天的小鼠心肌细胞，使其感染永生化质粒SSR#69而永生化，通过抗生素筛选法和无限稀释法获得永生化的单克隆心肌细胞，再从中筛选出表达ISL1和Tbx5的心肌细胞，即得；该心肌祖细胞为可回复性永生化细胞，既能无限增殖，又无致瘤和引起病毒感染的危险，是研究影响心肌祖细胞在成体心肌细胞受损情况下增殖和分化因素的理想工具，有着良好的应用前景。

主权项

小鼠心肌祖细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：a、分离培养胚胎15.5天的小鼠心肌细胞；b、将步骤a所得心肌细胞感染永生化质粒SSR#69而永生化，通过抗生素筛选法和无限稀释法获得永生化的单克隆心肌细胞；c、根据心肌细胞发育过程中基因表达时序和ATRA诱导MyHC‑GLuc活性，以及免疫荧光法验证，筛选出具有心肌祖细胞特性的克隆，其表达心肌祖细胞标志物ISL1及心肌细胞系早期标志物Tbx5，还表达心肌细胞系早期标志物Nkx2.5，干细胞标志物Oct3/4、Nanog和Sox2，以及心肌祖细胞标志物Sca‑1和c‑kit，并经诱导分化后表达α‑MyHC；在进一步的实时定量PCR和免疫荧光筛选过程中，选取在Dex诱导分化过程中心肌祖细胞标志物ISL1及心肌细胞系早期标志物Nkx2.5和Tbx5表达呈下降趋势，心肌细胞结构蛋白标志物α‑MyHC、α‑actin和cTnT表达呈上升趋势，骨骼肌标志物MyoD和平滑肌标志物SM‑MHC几乎不表达的克隆为较优克隆；具体方法如下：RT‑PCR筛选心肌祖细胞：选取祖细胞标志物ISL1、心肌细胞系标志物Nkx2.5和Tbx5作为筛选心肌祖细胞的主要指标，干细胞标志物Oct3/4、Nanog和Sox2用于检测所分离的细胞是否具有干细胞自我更新的标志基因，其他的祖细胞标志物和心肌细胞系标志物Sca1、c‑kit、GATA4、Hand2、Flk‑1、α‑MyHC、α‑actin、cTnI和ANF用于辅助衡量细胞所处的心肌细胞发育阶段，根据上述指标，采用RT‑PCR从步骤b所得永生化的单克隆心肌细胞中筛选心肌祖细胞，并以常用于研究心肌细胞发育的P19CL6和H9C2作为对照；所述ISL1、Sca1、c‑kit、Nkx2.5、α‑MyHC、Oct3/4、Nanog、Sox2、GATA4、Tbx5、Hand2、Flk‑1、α‑actin、cTnI和ANF的PCR引物序列分别如SEQ ID No.1～2、SEQ ID No.3～4、SEQ ID No.5～6、SEQ ID No.7～8、SEQ ID No.11～12、SEQ ID No.17～18、SEQ ID No.19～20、SEQ ID No.21～22、SEQ ID No.23～24、SEQ ID No.25～26、SEQ ID No.27～28、SEQ ID No.29～30、SEQ ID No.31～32、SEQ ID No.33～34和SEQ ID No.35～36所示；ATRA诱导MyHC‑GLuc活性筛选心肌祖细胞：将2μg MyHC‑GLuc、15μl Lipofactamine和500μl DMEM空白培养基混匀，室温下放置10～30分钟，制得转染混合物；分别将处于指数生长期的步骤b所得永生化的单克隆心肌细胞以60～80％的密度接种到细胞培养瓶中，用DMEM完全培养基在37℃、体积分数为5％的CO2和饱和湿度的条件下培养，待细胞贴壁后，吸除培养基，用3.0ml DMEM空白培养基洗涤1次，加入2.5ml DMEM完全培养基，孵育10分钟，再加入上述转染混合物，孵育4小时后更换为DMEM完全培养基，12小时后加入终 浓度为0.5μmol/L的ATRA溶液诱导分化，激活MyHC‑GLuc活性，分别于诱导后第3、6、12和18天吸取20μl细胞培养上清液，用GLuc检测试剂盒检测GLuc的表达量，按照试剂盒说明书操作；免疫荧光检测ISL1和c‑kit在ISL1/Tbx5双阳性克隆中的表达情况：进一步验证RT‑PCR结果，采用免疫荧光法检测ISL1和c‑kit在ISL1/Tbx5双阳性克隆中的表达情况，同时以2个ISL1/Tbx5双阴性克隆作为对照；实时定量PCR检测Dex诱导分化心肌祖细胞的心肌发育相关基因的表达：将筛选出的具有心肌祖细胞特性的克隆分别用0.5μmol/L的Dex溶液诱导分化，第7天和第11天时提取细胞总RNA，通过RT得到cDNA，再进行心肌发育相关基因ISL1、Nkx2.5、α‑MyHC、α‑actin、cTnT、Tbx5、MyoD和SM‑MHC的实时定量PCR检测，并将结果以GAPDH为内参进行校正；所述ISL1、Nkx2.5、α‑MyHC、α‑actin、cTnT、Tbx5、MyoD和SM‑MHC的PCR引物序列分别如SEQ ID No.1～2、SEQ ID No.7～8、SEQ ID No.11～12、SEQ IDNo.13～14、SEQ ID No.15～16、SEQ ID No.25～26、SEQ ID No.37～38和SEQ ID No.39～40所示；免疫荧光检测Dex诱导分化心肌祖细胞的cTnT表达：将筛选出的具有心肌祖细胞特性的克隆分别用0.5μmol/L的Dex溶液诱导分化，第14天时固定细胞，采用免疫荧光法检测心肌细胞结构蛋白cTnT的表达。