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一种利用大肠杆菌TOP10/PBAD/Thio‑TOPO‑ Arg‑Bsub基因工程菌生产L‑鸟氨酸盐酸盐的方法, 该大肠杆菌基因工程菌保藏编号CCTCC No. M2010358；生产方法包括如下步骤：(1)将低温保存的大肠杆菌TOP10/PBAD/Thio‑TOPO‑ Arg‑Bsub基因工程菌株在含有100µg/ml Amp的平板上划线，37℃倒置培养，得到单菌落；(2) 将Amp平板上长出的单菌落接种到含有100µg/ml的Amp的3.5ml LB培养基的试管中， 37℃、225r/min，振荡培养过夜，得到一级种液；(3) 取培养好的一级种液9ml接种到装有100ml 2%的玉米浆培养基的摇瓶中，37℃、225r/min,振荡培养8小时,得到二级种液；所述2%玉米浆培养基配制方法如下：玉米粉20g/L、味精15g/L、磷酸氢二钾10g/L、硫酸镁10g/L，加水定容到1000ml，pH7.0；分装成100ml/份至三角瓶，盖上瓶盖，121℃灭菌20min，备用；(4)取培养好的二级种液1.2L接种到30L 4%的玉米浆培养基中,发酵温度控制在37℃，培养过程中补加600ml灭菌甘油，整个发酵过程中，用浓氨水调pH7.0～8.0，调整搅拌速度和空气流量，使溶氧量不低于20%，当细菌生长至OD600=6.0,降温至30℃，并加入3g L‑Ara进行诱导，在诱导5h后，每隔1h取样检测菌体酶活变化，诱导8h后出料；(5) 将发酵好的菌液在4℃，5000r/min，离心10min，弃上清，收集湿菌体；(6) 在200升的搪瓷反应釜中加纯化水100升，在搅拌下，投进L‑精氨酸15kg,用6M的盐酸调节pH至9.0，加锰离子使溶液中Mn2+终浓度为10μmol/L,夹套水浴升温，温度达到并维持在38℃，待温度稳定后，加入900g工程菌，继续搅拌酶解，当酶解19小时时，取样利用薄层层析检测残余精氨酸，溶液中的残余精氨酸≤2%时进入下一工序；其中薄层层析所用的展层剂配比为：正丁醇：丙酮：浓氨水：水=10：10：5：2；(7) 用6M盐酸将酶解液pH调到5.0，60℃，保温搅拌30min; 加入2.25kg活性炭，60℃，脱色30min后，板框过滤；(8) 滤液在0.08MPa以上的真空下浓缩，出料；(9)加入1.2kg活性炭再次脱色，溶液进行抽滤，滤液在0.08MPa以上的真空下再次浓缩，出料；(10) 加入1倍体积的95%的食用乙醇，L‑鸟氨酸盐酸盐结晶析出，0℃盐水中降温结晶8个小时，离心机甩干，用8升的85%的乙醇洗涤两次并甩干产品；母液和洗涤液合并，用盐酸调节pH4.5，加入0.5公斤活性炭60℃脱色，将滤液真空浓缩至8.8升，调节pH至4.5，加95%的乙醇8.5升，搅拌均匀，置0℃盐水中降温8小时，L‑鸟氨酸盐酸盐结晶析出，离心机甩干；合并两次的产品用于进一步回收L‑鸟氨酸盐酸盐产品。 |
