基因免疫制备人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的方法

摘要

本发明公开了一种基因免疫制备人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的方法，步骤为：以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物,通过RT-PCR,得到NSE基因SEQ ID NO.3；将NSE基因接入pGEM-T，形成质粒pGEM-T-NSE；转染入BEL7402细胞中，培养，从细胞裂解液中纯化出NSE重组蛋白；用质粒注射小鼠；取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合得杂交瘤细胞；培养；筛选能产生针对NSE蛋白表位单抗的阳性杂交瘤细胞；将阳性杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔内使产生腹水；纯化得到人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体。本发明缩短了杂交瘤细胞前期筛选时间，使生产简单，操作容易，周期更短。

主权项

一种基因免疫制备人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的方法，其特征是包括如下步骤：（1）以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为上、下游引物,通过RT‑PCR,从人肝癌细胞株BEL7402中扩增人NSE分子的cDNA全长，经TA克隆后进行DNA序列分析，确定正确的NSE基因序列SEQ ID NO.3，所述NSE为人神经元特异性烯醇化酶的简称；（2）将SEQ ID NO.3所示基因序列定向连接入真核分泌型载体pGEM‑T的NcoI和XhoI位点之间，形成质粒pGEM‑T‑NSE；（3）将质粒pGEM‑T‑NSE转染入BEL7402细胞中，通过细胞培养，从细胞裂解液中纯化出NSE重组蛋白；（4）用所述质粒pGEM‑T‑NSE多点注射于Balb/c小鼠的股四头肌；（5）取经步骤（4）免疫的小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞；（6）将所述杂交瘤细胞用参有荧光标记的步骤（3）获得的NSE重组蛋白的甲基纤维素制备的半固体培养基培养；（7）将步骤（6）培养获得的杂交瘤细胞利用步骤（3）获得的NSE重组蛋白通过ELISA方法筛选能产生针对NSE蛋白表位单抗的阳性杂交瘤细胞株；（8）将步骤（7）获得的阳性杂交瘤细胞株注射于Balb/c小鼠腹腔内使所述小鼠产生腹水；用蛋白G柱亲和纯化得到人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体。