一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法

摘要

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，包括1）提取病毒RNA；2）RT-PCR扩增；3）套式PCR扩增；4）PCR产物的克隆及测序分析等步骤。扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的S部分基因，扩增片段长782bp(位于S基因的1316bp-2097bp)，并且包含位于S基因1495bp-1914bp之间的中和抗原表位，实现能扩增在vero细胞上培养的不同代次的PEDV种毒的S基因，捕捉到了猪流行性腹泻病毒在细胞培养传代过程中S基因，特别是中和抗原表位的序列变化，从而能了解其与PEDV免疫效力变化的相关性。

主权项

一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于其包括以下步骤：1）提取病毒RNA：原病料经12000rpm离心5分钟后取上清液或者细胞培养液‑20℃反复冻融2‑3次，然后采用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0(DV819A)提取病毒RNA；2）RT‑PCR扩增：设计引物SEQ ID NO:1和引物SEQ ID NO:2，采用TaKaRa PrimeScript one step RT‑PCR Kit Ver.2进行扩增； 3）套式PCR扩增：设计引物SEQ ID NO:3和引物SEQ ID NO:4，对步骤2中的RT‑PCR扩增产物采用TaKaRa Premix Taq Version 2.0(D334S)扩增；4）PCR产物的克隆及测序分析：采用BIOMIGA Gel/PCR  Extraction Kit进行PCR产物的纯化；将纯化的PCR产物连接到pMD20‑T Vector载体上；连接产物转化DH5α感受态细胞；筛选阳性克隆并进行测序。