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福寿螺的纤维素酶定向进化方法，其步骤如下：第一步，获取福寿螺的纤维素酶基因：（1）先提取福寿螺的总mRNA—信使核糖核酸:（2）再进行反转录扩增cDNA—互补脱氧核糖核酸；（3）然后，通过PCR—聚合酶链式反应，扩增出福寿螺的纤维素酶基因；（4）最后，回收PCR产物，得到福寿螺的纤维素酶基因片段；该纤维素酶基因片段序列为SEQ ID NO：1所示的序列：atgccctctg gtgctgctgg tgctggggtg accagcgaga tcgaccgact gagaagaagc gacataacgg ttcacgtgaa tgttggtggt aacatcaacc acggtcaagt gagcattcga gtgttacaaa agagaaaggc attcccgttc gggacatgtg tggccgcctg ggcctacaac gatgggtcca aaggagcata ccgggatttc atccaccagc actacaactg ggccgtgcca gaaaactcac tcaagtgggc tagcatcgaa cctaacaggg gacaaaagaa ctatcagcct ggcctaaaca tgcttcacgg actgagaaat cacgggatta aggtgagagg tcacaacctg gtgtggtctg tcgacaatac ggtgcagaac tgggtcaagg ctctgcatgg ggatgagctg cgaaaggttg tccatgacca catcgtggaa accatcaaca catttaaggg attagtggag cactgggatg tgaacaacga gaacctgcat ggccagtggt accagcatca actgaatgac aatggctaca acctggaact gttccgtatc gcacacgccg ccgaccccaa cgtcaaactc ttcctcaacg actacaacgt tgtgtccaac agttattcaa caaacgacta tcttcgacaa ggtcaacagt ttaaggccgc taatgtgggt ctttacggtt tgggtgccca gtgccacttt ggcgacgaaa gcgacccaga acccggtact aagcaacgtc tggatacttt agctcaagtg ggcgtgccca tctgggccac tgagttggat gtggtagctt cggatgagaa cagacgagcg gacttctacg agcacgcgct gacagtcctg tacggccatc atgccgtgga gggcatcctc atgtggggct tctgggacaa ggcccactgg cgtggcgcca gagctgctct tgttgtcgga gacaacctgc agctgacggc ggccggacgt cgcgtgctgg agctctttga gcacaggtgg atgacagacg agacgcacaa cctggcagcg ggcactcagt tcacagtacg cggtttccat ggcgactacg aggtgcaagt catcgtccag ggtcaagagc acactaacct gaggcagacg ttctcgttgg gcaacggtcc ccacaccgtc aacattaatg ttagc 第二步，克隆和测序：（1）克隆PCR产物，将PCR产物与含有T末端的pMD18‑T载体连接；（2）感受态细胞的制备与转化，采用CaCl2法制备感受态细胞；（3）阳性克隆的筛选，用X‑gal和IPTG对克隆进行初步筛选；（4）提取质粒,用碱法提取质粒；（5）测序,重组质粒序列测定后,与www.ncbi.nlm.nih.gov网上比对，验证分析其序列的正确性;第三步，定点突变：（1）用分子生物学专业软件DNAman,DNAstar和专业网站http://swissmodel.expasy.org/workspace，通过跨膜蛋白质结构预测网http://www.sbc.su.se/miklos/DAS/进行在线分析，采用"DAS"‑Transmembrane Predictionserver进行功能分析预测，确定需要改造的氨基酸为：332缬氨酸突变为丙氨酸；能够增强纤维素酶与纤维素在空间结构上的相互作用；（2）纤维素酶蛋白的定向改造采用试剂盒进行定点突变，再进行测序确定；下面将332缬氨酸突变为丙氨酸说明定点突变的方法：1）设计引物：根据基因序列和定点突变的要求及试剂盒操作步骤，此纤维素酶蛋白第332位Val缬氨酸的密码子GTG突变为Ala丙氨酸的密码子GCG，设计出一对包含突变位点的引物P1和P2,具体序列如下：P1：5′GCAGCTGACGGCGGCCGGACGTCGCGCGCTGGAGCTCTTTGAGCACAGG3′；P2：5′CGTGTGCTCAAAGAGCTCCAGCGCGCGACGTCCGGCCGCCGTCAGCTGC3′；阴影部位的碱基为突变位置，所有引物均由上海博亚生物技术有限公司合成；2）PCR定点突变：一切均按Stratagene公司的Quik Change Site‑directed Mutagenesis kit使用说明进行。 |
