检测维生素C工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化的方法

摘要

本发明公开了一种检测维生素C工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法，包括如下步骤：(1)对维生素C发酵过程中所用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)细胞内的蛋白质进行测定：(2)聚类分析；(3)过程分析，利用本发明的方法可以从整体上研究维生素C工业混菌发酵过程中，细胞内蛋白变化规律，找到发酵过程中的重要蛋白，这些蛋白含量的变化规律为了解发酵过程的内在机理提供依据，从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量，降低环境污染提供理论基础。同时也为其他混菌发酵过程的研究提供新的思路和方法。

主权项

一种检测维生素C工业混菌发酵过程中细胞内蛋白质变化方法，其特征是包括如下步骤：（1）对维生素C发酵过程中所用的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌细胞内的蛋白质进行测定：①细胞收集及淬灭：将所述巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌进行发酵，在发酵过程中选3‑5个时间点，所述时间点位于所述发酵过程的前期、中期和后期，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨用于破碎细胞，获得3‑5份破碎细胞；②提取细胞内蛋白：取步骤①获得的3‑5份破碎细胞100～200mg分别置于离心管中，加入0.5～2ml细胞裂解液，混匀，冰上间歇超声破碎20～50s；加入5～15μL的质量比为2～4:1的DNase Ⅰ/RNaseA酶混合溶液，混匀，4℃静置反应10～30min；加入5～15μL 80～120mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置1～3h；15000rpm离心25～40min；取上清，加4～6倍体积的‑20℃～‑40℃的丙酮，沉淀12～20h；离心，弃上清，沉淀用‑20℃～‑40℃的体积浓度为70%‑85%的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；③蛋白浓度测定：将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G‑250溶液中，测定蛋白在595nm处的吸光值，建立标准曲线；将步骤②获得的蛋白分别溶于300μL溶胀液中，测定蛋白浓度；并分别按500～1000μg分装，‑80℃贮存，所述溶胀液为：8mol·L‑1尿素，质量浓度为2%的CHAPS，体积百分浓度为0.5%的固定pH梯度胶条缓冲液,余量为水；④一维等电聚焦电泳采用胶内泡胀上样法，将步骤③获得的各个500～1000μg蛋白样品溶液用溶胀液补齐至350μL，加入1.0～1.5mg二硫苏糖醇，均匀铺于胶槽内，放入IPG干胶条，覆盖一层矿物油，盖上胶槽盖，进行一维等电聚焦电泳；用平衡液I平衡10～20min、平衡液II平衡10～20min；所述平衡液I的组成为：50mmol·L‑1pH为8.8的Tris‑HCl，质量浓度为2%的SDS，质量浓度为1%～2%的二硫苏糖醇，6mol·L‑1尿素，体积浓度为20～40%的甘油，痕量的溴酚蓝，余量为水；所述平衡液II的组成为：50mmol·L‑1pH为8.8的Tris‑HCl，质量浓度为2%的SDS，质量浓度为2%～3%的碘乙酰胺，6mol·L‑1尿素，体积浓度为20～40%的甘油，痕量的溴酚蓝，余量为水；⑤SDS‑PAGE电泳配制SDS‑PAGE溶液：质量浓度为11%～15%的聚丙烯酰胺，3.75M·L‑1pH为8.8的Tris‑HCl，质量浓度为1‰的SDS，质量浓度为0.2‰～0.3‰的过硫酸铵，体积浓度为0.5‰～1.5 ‰的N,N,N’,N’‑四甲基乙二胺，余量为水；待胶凝后得到凝胶，将步骤④获得的平衡后的胶条放入凝胶上端，放入14kD～110kD蛋白标记，加入4～5ml质量浓度为0.9%～1.5%的低熔点琼脂糖水溶液，待胶凝后，将其放入垂直电泳槽中，在80～100V恒压下进行第二维电泳，直到溴酚蓝到达胶的前沿时停止；⑥图像分析将步骤⑤获得的凝胶染色，用扫描仪投射扫描，将得到的图像用ImageMaster软件进行分析，得到蛋白相对含量的数据，找出明显的差异蛋白；⑦差异表达蛋白鉴定将差异蛋白在37℃，用胰蛋白酶胶内酶切，通过质谱MALDI‑TOF‑TOF，测定差异蛋白；（2）聚类分析：采用Expander4.0对步骤（1）⑥中得到的数据进行标准化后，进行K‑方法聚类，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；（3）过程分析将步骤（2）获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现其在维生素C工业混菌发酵过程中的作用。