一种培育转基因固氮植物的方法

摘要

本发明公开了一种培育转基因固氮植物的方法，利用SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和带有烟草花椰菜花叶病毒35S启动子的载体构建重组表达载体，并将此重组表达载体导入到目的植物中，得到与正常目的植物相比固氮能力增强的转基因植物。本发明基于申请人发现的gma-miR172c的新功能，通过基因工程方法使gma-miR172c在目的植物中过表达，得到与正常目的植物相比固氮能力增强的转基因植物。

主权项

一种培育转基因固氮植物的方法，其特征在于：使序列表中SEQ ID NO：1所示的gma‑miR172c在目的植物中过表达，得到与正常目的植物相比固氮能力增强的转基因植物；具体操作步骤如下：A、Wilimas82大豆叶片组织中总RNA的提取研钵经 180℃高温处理8 小时或经燃烧处理以消除RNA 酶污染；氯仿、异丙醇，乙醇试剂使用新开封未被污染的；其它器材枪头、离心管和试剂超纯水、NaAc，均经1 ‰ DEPC水处理过夜后121°高温湿热灭菌30分钟，枪头、离心管65°烘干备用；采用Trizol法提取大豆总RNA：（1）取 50mg 叶片材料用液氮研磨，加入1 ml redzol 试剂，充分匀浆后，将匀浆液吸入1.5 ml 离心管，室温放置5 min；（2）加200 μl 氯仿，震荡混匀，静置2‑3min，12000 g 4℃离心10min；（3）取上清于另一离心管，加等体积异丙醇，‑20°放置30 min，12000 g 4 ℃离心10min；（4）1 ml 75%乙醇洗沉淀，7500 g 离心5min，两次重复；室温风干10min ，加20 μl  DEPC处理过的无菌水溶解沉淀；B、反转录PCR（1）在用DEPC 处理过的的200μl PCR管中顺序加入5μL RNA 和3μL oligo (dt)18；4μLdNTPs，65℃温育5min 后迅速置于冰上冷却；（3）按以下顺序加入以下溶液：5X M‑MLV buffer4μl，RNase inhibitor 1μl，M‑MLV 1μl，0.1M DTT 2μl；（4）将上述反应液混匀，37℃反应1.5 小时；（5）反应结束后，70℃处理10min 灭活逆转录酶活性；反应合成的cDNA 第一条链可用作PCR反应模板；C、构建重组表达载体（1）gma‑miR172c基因的克隆根据SEQ ID NO：3序列设计引物对，根据载体pEGAD多克隆位点，引物末端分别引入AgeⅠ和Spe I酶切识别位点，以大豆测序品种W82的cDNA为模板进行PCR，扩增gma‑miR172c前体的编码基因；引物序列为：gma‑miR172c‑F：5'‑ TGCACCGGT ATGAAGTCCTAAATAAAC ‑3'，即SEQ ID NO：8；gma‑miR172c‑R：5'‑ GGACTAGT TCCTCCTCAAGCAATATCTG ‑3'，即SEQ ID NO：9；扩增程序为：95 ℃ 5分钟；95 ℃ 30 秒，57 ℃ 30秒，72 ℃ 40秒，26 个循环；72 ℃ 7分钟；PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化203bp的条带；回收的 DNA 片段与pMD19‑T载体连接，10μl体系中加入T vector 1 μl，solutionⅠ5μl，回收片段4μl，混匀混合液，16 °C 连接过夜，热击法转入E.coli 感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆，送交invitrogen公司测序；(2) 重组表达载体的构建1）、提取含有正确测序的gma‑miR172c前体基因序列的T载体质粒，用限制性内切酶AgeⅠ和Spe I酶切，回收酶切产物；2）、用限制性内切酶AgeⅠ和Spe I酶切空载体pEGAD，回收载体骨架；3）、用T4连接酶将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接；4）、将步骤3的连接产物热激转化感受态DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pEGAD‑35S::gma‑miR172c；D. 农杆菌K599介导的毛状根转化：（1）农杆菌的转化，采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作如下：a.取出冻存的200 μl 感受态细胞，融化后加入5‑10 μl 质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20‑30 min；b.放入液氮中5min后取出，将管转入37°C ，5 min融化后，加入800μl  LB无抗性液体培养基，28°C 低速振荡 ，150 rpm、4‑5 h；d.10000 rpm，30 sec, 去上清，加100 μl LB 液体培养基，悬浮菌体后涂板，含50mg/ml 卡那霉素；e.置28°C 培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化；（2）农杆菌K599介导的毛状根转化以大豆品种吉林小粒1号为材料，取种子材料用氯气消毒10小时后，在B5培养基上萌发5天，培养基配方：2％蔗糖，0.8 sigma琼脂粉，1×GAMBORG B‑5 BASAL，pH调至5.7 ；待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌K599中侵染30min后，将外植体转至1/2 MS培养基上，培养基配方：2％蔗糖，0.8 sigma琼脂粉，0.5×MURA SHIGE & SKOOG BASAL MEDIOM w/VITAMINS，pH调至5.7；共培生长3天后，再转至1/2 MS培养基上诱导毛状根，7天后，毛状根长出，待大豆真叶长出，毛状根达到7‑8cm后，选择发育阶段接近的毛状根复合苗移入蛭石：珍珠岩=3:1的无土基质中，培养1周后接种根瘤菌USDA110 20ml/株，培养28天后收取根瘤，统计根瘤数量。