猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法、抗体及应用

摘要

本发明公开了猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法、抗体及应用。本发明以超离纯化的猪圆环病毒Ⅱ型作为免疫原，按常规方法免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0细胞融合，经间接ELISA筛选获得了2株分泌PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为8-60、10-48，对其生物学特性进行鉴定，并将其作为一抗，建立了间接免疫荧光诊断方法。该间接免疫荧光诊断方法，与PCR诊断方法的结果基本一致，阳性和阴性符合率分别为93.75％和100％，为预防和治疗猪圆环病毒病提供了参考。

主权项

一种猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于：所述的猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体由如下步骤制得，(1)将冻存的PCV2复苏后扩大培养，超速离心，收集沉淀，超声波裂解，蛋白含量测定仪测定其质量浓度，‑70℃～80℃冻存备用；(2)取健康7～8周龄BALB/c小鼠数只，颈背部皮下多点注射免疫，其中抗原PCV2全病毒剂量为首免100μg，二免100μg，三免180μg，免疫间隔14天，三免14天后尾静脉采血测抗体效价，选效价高数量级在107以上的小鼠在细胞融合前3天脾脏注射50μg加强免疫，(3)无菌摘取小鼠脾脏，制成脾细胞，按1∶5的体积比比例取脾细胞和骨髓瘤细胞混合，离心后，弃上清液；缓慢加入体积分数50％PEG 4000进行融合；用体积分数1％HAT培养液重悬融合细胞，加至96孔培养板中，每孔105个细胞/100μL，置CO2培养箱中培养，每天记录细胞生长情况；(4)待96孔板中有融合细胞生长，且液体稍微变黄时，吸取培养液，用包被Cap蛋白的间接ELISA方法进行筛选，选择强阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆；经几次亚克隆后，即获得稳定分泌猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体且效价高的杂交瘤细胞，所述的猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体，利用如下方式鉴定：(1)利用间接ELISA检测杂交瘤细胞培养上清液的效价，(2)用单克隆抗体分型试剂盒进行分型鉴定，经亚型鉴定表明抗体的免疫球蛋白均为IgM，(3)杂交瘤细胞的染色体分析将传代2～3天的杂交瘤细胞取出，向细胞瓶内加入含1/15mol/L秋水仙碱的培养基，继续培养5h，使染色体停止在分裂中期，1,000r/min离心10min，收集细胞，用10mL 5g/L KCl溶液重悬，置37℃水浴低渗处理25min，加入1mL的V甲醇∶V冰醋酸＝3∶1的细胞固定液预固定2min，1,000r/min离心10min，弃上清液，用新鲜固定液将细胞重悬，在4℃固定过夜，根据细胞压积的多少留一定量的固定液将细胞悬浮，滴管吸取细胞悬液少许滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即吹散，火焰固定，用体积分数10％姬 姆萨Giemsa染色液染色10min，洗去染液自然干燥，于显微镜下观察计数，每株细胞计数10个细胞染色体数，计算平均值(4)间接免疫荧光特性分析PCV2感染96孔板上生长的PK15细胞，待细胞长成单层后弃上清液，用无水乙醇固定，PBS洗涤3次，分别将制备获得的两株单克隆抗体腹水按不同浓度加入96孔板中，37℃反应60min，PBS洗3次，加入FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃反应30min，PBS洗涤3次，荧光显微镜下观察，将PBS作为阴性对照，小鼠阳性血清作为阳性对照，有绿色荧光者判为阳性，无荧光者判为阴性，(5)单克隆抗体的鉴定还包括其结合位点分析，用间接ELSIA叠加实验分析单克隆抗体的结合位点，根据腹水单克隆抗体的效价，将腹水单克隆抗体分别稀释至饱和时的工作浓度，在此浓度下各取50％两两混匀，分别测定腹水单克隆抗体混和后的及饱和浓度下的效价，计算加成指数AI＝[2A1+2/(A1+A2)‑1]×100％，式中A1、A2分别为2株不同单克隆抗体所测的效价，A1+2为两两混和抗体所测的效价，每组重复实验3次，计算其平均值，AI值大于50％即认为两种单克隆抗体识别不同的抗原表位。