新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法

摘要

本发明公开了一种新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法，将含有血小板生成素拟肽基因的大肠杆菌工程菌高密度发酵后，将菌体超声破碎，尿素裂解，复性，调pH值，经Protein-AMabselectSuRe层析、SPSepharoseH.P层析和SephacrylS-200分子筛层析进行组合纯化，生产出符合药典规定的血小板生成素拟肽蛋白。本发明的有益效果是：复性率高，纯化工艺组合合理，操作程序简化，收率高，生产成本低，为血小板生成素拟肽大规模生产提供可能。

主权项

血小板生成素拟肽复性和纯化方法，其特征在于，包括下列步骤：（1）超声破菌：将含有血小板生成素拟肽基因的大肠杆菌工程菌高密度发酵后，每克菌体加入10ml预冷的TE缓冲液，所述TE缓冲液为含有5mM EDTA的50mM Tris‑HCl，pH值为8.5，混匀后加入溶菌酶至溶菌酶的浓度为1%（重量/体积），充分混匀，温度保持在2～8℃，作用1小时以上；超声破菌2min/次，共6次；然后在2～8℃温度下以8500转/分钟的速度离心15分钟，收集沉淀；所述血小板生成素拟肽含有两个相同的亚单位，每个亚单位由一个IgG1Fc结构区和c‑Mpl结合区共价结合构成；（2）TE缓冲液洗涤：将步骤（1）收集的沉淀物按1:10（重量/体积）加入含0.5%Tritron X‑100的TE缓冲液洗涤，在2～8℃温度下以8500转/分钟的速度离心15分钟，收集沉淀；再重复此步骤，收集沉淀；所述TE缓冲液为含有5mM EDTA的50mM Tris‑HCl，pH值为8.5；（3）室温裂解：将步骤（2）收集的沉淀物按1:10（重量/体积）加入包涵体裂解液中，搅匀，室温裂解1小时；所述包涵体裂解液的组成为6M盐酸胍、50mM Tris‑HCl和8mM DTT，所述包涵体裂解液的pH值为9.0；（4）复性：将步骤（3）裂解后的混合溶液滴加至复性液中，稀释后的蛋白浓度为1～2mg/ml，在2～8℃的温度下搅拌48小时，再用pH9.0的10mM Tris‑HCl和1.5M尿素稀释1～5倍；所述复性液的组成为1～3M尿素、50mM Tris‑HCl、1～10mM还原型谷胱甘肽和1mM氧化型谷胱甘肽，所述复性液的pH值为8.0～9.0；（5）调节PH和离心：用醋酸调节pH值至5.0，离心去除沉淀物，收集溶液；（6）将溶液依次进行Protein‑A Mabselect SuRe层析、SP Sepharose H.P层析和Sephacryl S‑200分子筛层析。