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一种云南大百合原生质体超低温保存方法，其特征在于按以下步骤进行：1）愈伤组织诱导：用云南大百合种子萌发出的幼胚为外植体，用水冲洗外植体后，用75% 的酒精浸泡30 s，再用0.1%的升汞消毒5 min，无菌水冲洗3～ 4 次，将消毒后的外植体接种在愈伤组织诱导固体培养基： MS+2～3 mg/L KT+1～2 mg/L 2,4‑D +3%蔗糖+0.7%琼脂粉，温度为23～27℃黑暗培养，40天后诱导出愈伤组织； 2）云南大百合原生质体分离：取上述愈伤组织1～2g，切成约0.2～0.3cm2小块,置于10mL离心管中,按材料与酶液1:10～15比例加入酶液，25～28℃黑暗中酶解8～12个小时，其中酶解液为：1.5～3%纤维素酶+0.5～2%离析酶+ 0.5～0.7mol／L甘露醇+3～8mmol/L CaCl2.2H2O+0.5～0.7mmol/L KH2PO4, pH 6.8～7.0，并经过滤灭菌；3）云南大百合原生质体纯化：上述酶解后，用孔径为300目的细胞筛将原生质体酶解液过滤至无菌的离心管中，除去较大组织和大量细胞团，将离心管置于1000rpm下离心6min；离心结束后去除上清液留沉淀，用5～8ml CPW13将沉淀悬浮，1000rpm下离心5min，离心结束后去除上清液留沉淀，在离心管中加入3～5ml CPW 21，然后再在其上面缓慢的加入1～2 ml CPW 13，900rpm下离心7min，原生质体在两液面间形成一条带，其它杂质及少量原生质体沉于管底，将界面处原生质体吸出，用3～5ml 1/2MS+1.2mol/L蔗糖液体培养基洗涤1～2次，1000rpm下离心5min弃去上清液，获得纯净原生质体备用； 4）冻存：取0.1～0.2g上述原生质体，放入2ml冻存管中，在室温下加入1～1.5ml预处理液，预处理液为：25%PVS2+75%MS放置30～40min, 800rpm下离心3min，收集原生质体，用1～1.5ml 的60%PVS2+40%MS于0℃下处理5～10min, 800rpm下离心3min，收集原生质体，马上加入0℃下预冷的新鲜的玻璃化试剂100%PVS2 1～1.5ml,脱水3～5 min, 快速投入液氮中保存；5）解冻：将冻存管置于35～45℃水浴中解冻，800rpm下离心5min，收集原生质体，用3～5ml 1/2MS+1.2mol/L蔗糖液体培养基洗涤，800rpm下离心5min，去上清，重复洗涤1次，再用MS+2～3 mg/L KT+1～2 mg/L 2,4‑D +3%蔗糖液体培养基悬浮原生质体，得到保存后的原生质体。 |
