DNA分子和方法

摘要

本发明公开了包含II型内含子的DNA分子，其中所述II型内含子不表达内含子编码的逆转录酶但包含经修饰的反向的选择性标记基因，其中所述标记基因包含正向的I型内含子，从而在梭菌纲细菌细胞中引起表达，并且其中所述DNA分子包含容许将所述II型内含子的RNA转录本插入到梭菌纲细菌细胞的基因组中的序列。本发明还提供了将核酸分子引入到梭菌纲细菌细胞中的DNA分子的位点的方法。所述DNA分子和方法可用于在梭菌中产生突变。

主权项

DNA分子，其为大肠杆菌‑梭菌穿梭载体，且其包含：经修饰的II型内含子，其不表达内含子编码的逆转录酶，但在相对于经修饰的II型内含子的反方向上包含选择性标记基因，其中所述选择性标记基因包含编码红霉素抗性或氯霉素抗性的编码区域和可操作性地连接到所述区域的启动子，其中所述启动子能够引起由单拷贝选择性标记基因编码的选择性标记的表达，其表达量足以使所述选择性标记改变梭菌纲细菌细胞的表型，从而使其能够区别于不含所述选择性标记基因的梭菌纲细菌细胞，所述启动子选自丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)的thl或ptb或adc基因启动子或产气荚膜梭菌(C.perfringens)的fdx或cpe基因启动子；和IPTG诱导型或木糖诱导型启动子，其用于所述经修饰的II型内含子的转录，所述启动子可操作性地与所述经修饰的II型内含子相连；和其中所述经修饰的选择性标记基因包含I型内含子，从而破坏所述选择性标记的表达，其中所述I型内含子位于相对于所述经修饰的II型内含子的正方向并且位于所述选择性标记的编码区内或所述选择性标记的编码区的上游；和其中所述DNA分子容许从经修饰的II型内含子的RNA转录本中除去所述I型内含子，从而获得编码所述选择性标记的编码区域，并容许在梭菌属细菌细胞的基因组内位点插入所述RNA转录本或其DNA拷贝。