禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性基因频率的高通量分子检测方法

摘要

本发明属于禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵抗药性基因频率的高通量分子检测方法，可用于小麦赤霉病菌的抗药性监测和抗药性病害流行的早期预警。本发明基于97％以上的禾谷镰孢菌对多菌灵的抗药性基因型属于β2-微管蛋白基因167位点突变的研究基础建立起来的一种抗药性高通量检测技术。该检测方法共分3个主要步骤，(1)分别提取已知敏感和抗药性菌株及待测样品的基因组DNA；(2)进行特异性实时定量PCR反应，建立标准曲线；(3)对照标准曲线求出测定样品中的抗药性基因频率。该方法具有高通量、快速、准确的特点。抗药性基因频率检出灵敏度可达万分之一至十万分之一，准确率达96％以上。

主权项

1.禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵产生中等抗性水平(中抗)的抗药性基因频率的实时检测方法，其特征在于采用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)技术的Cycling探针特异性，根据中等抗性水平菌株β₂-微管蛋白基因的第167位氨基酸密码子由TTT(Phe)→TAT(Tyr)，设计了①扩增禾谷镰孢菌β₂-微管蛋白基因片断的引物对β₂-微管蛋白基因上游引物5′AAGCCATTGATGTTGTTCG 3′β₂-微管蛋白基因下游引物5′CATGACGGTAGAAATCAGGTAG 3′②特异性Cycling探针P1 5’-(FAM)CATAACGGAAGG(Eclipse)-3’P2 5’-(HEX)CATAACGGAAGG(Eclipse)-3，能够高通量检测病样中该菌群体对苯并咪唑类杀菌剂产生中抗水平的抗药性基因频率。