微囊藻毒素LR的单链抗体的筛选方法及其鉴定

摘要

本发明涉及一种微囊藻毒素LR的单链抗体的筛选方法及其鉴定。是将生物素化的微囊藻毒素LR利用亲和素标记磁珠和负筛选方法，在人源合成抗体库中进行两轮亲和筛选；再对第二轮产出的噬菌体克隆提取总质粒DNA，经过Sfi I酶切后胶回收得到单链抗体基因，与同样酶切后的可溶性表达的载体pAK100CL进行连接，连接后的载体电转化入大肠杆菌XL1-Blue中，获得可溶性表达的单链抗体；用竞争型时间分辨荧光免疫分析法，对可溶性表达的单链抗体进行鉴定。其优点是：本发明具有筛选快速简便，并能更好的将微囊藻毒素LR立体结构暴露于孵育体系中；同时对筛选结果的鉴定，具有检测信号高、抗基质干扰能力强的优点。

主权项

一种微囊藻毒素LR的单链抗体的筛选方法，是将半抗原利用亲和素标记磁珠和负筛选方法，在人源合成抗体库中进行两轮亲和筛选，获得能够展示型表达微囊藻毒素LR特异性单链抗体的M13丝状噬菌体克隆；再将第二轮筛选获得的噬菌体克隆的单链抗体基因与可溶性表达载体连接，转入大肠杆菌进行表达，获得可溶性表达的单链抗体，其特征在于：所述的半抗原为生物素化的微囊藻毒素LR；所述的可溶性表达载体为pAK100CL；所述的转入大肠杆菌进行表达是指：对第二轮产出的噬菌体克隆提取总质粒DNA，经过Sfi I酶切后胶回收得到单链抗体基因，再与同样酶切后的可溶性表达的载体pAK100CL进行连接，连接后的载体电转化入大肠杆菌XL1‑Blue中；所述的用亲和素标记磁珠和负筛选方法，在人源合成抗体库中进行两轮亲和筛选是指：在第一轮筛选中，将1nmol的生物素加入亲和素标记磁珠结合后，再加入人源合成抗体库预孵育，去除抗体库中针对生物素、亲和素和磁珠部分的非特异性噬菌体，实现负筛选；再将负筛选后的抗体库与结合有生物素化微囊藻毒素LR的亲和素标记磁珠进行孵育，在磁性支架上快速分离得到带有微囊藻毒素LR特异性噬菌体的磁珠，用胰蛋白酶将磁珠上的噬菌体洗脱下来；在第二轮筛选中，将第一轮筛选获得的噬菌体，先重复第一轮筛选相同的方法实现负筛选后，加入5pmol的生物素化的微囊藻毒素LR孵育后，再加入亲和素标记磁珠继续孵育，然后在磁性支架上快速分离磁珠，弃去上清，用胰蛋白酶将磁珠上的噬菌体洗脱下来；用胰蛋白酶将磁珠上的噬菌体洗脱下来是指：用含0.5％Tween20的TBST洗涤磁珠2次，加入50μl 60μg/ml的胰蛋白酶，振荡器低速振荡30min，将噬菌体从磁珠上洗脱下来，再加入50μl 100μg/ml的胰蛋白酶抑制剂终止反应。