三叶青转基因毛状根的诱导和繁殖方法

摘要

本发明提供了一种三叶青转基因毛状根诱导和繁殖的方法。本发明利用发根农杆菌K599侵染三叶青特定的外植体，通过改善发根农杆菌K599的活力，筛选侵染的合适外植体，优化毛状根诱导培养基，成功诱导出毛状根；进一步可通过改良毛状根除菌条件，优化毛状根繁殖的培养基和条件，获得快速生长、高效合成药用活性成分的毛状根的根系。本发明将为利用毛状根工厂化生产三叶青药用活性成分提供技术基础和支撑，为解决珍稀药材三叶青的资源替代问题提供一条新的途径，有利于三叶青资源的保护性利用和可持续性发展，具有很好的开发应用前景。

主权项

三叶青转基因毛状根的诱导和繁殖方法，所述方法包括：（1）外植体的预培养：取三叶青自然生长的植株靠顶端30 cm以内的茎段，经清洗、消毒后切成0.5~1.0 cm的小段；所得三叶青的茎段外植体在无菌条件下接入含萘乙酸0.5 mg/L +维生素C 0.1 g/L+半胱氨酸0.1 g/L的MS固体培养基或含萘乙酸0.5 mg/L +维生素C 0.1 g/L+活性碳1 g/L的MS固体培养基中，在24℃，遮盖黑暗条件下预培养20~25天；（2）侵染和共培养：将经过预培养的茎段外植体放入三角烧瓶中，加入发根农杆菌K599侵染菌液使菌液浸没外植体，在摇床上以50 r/min的转速侵染5~10 min，侵染后的茎段外植体转入含乙酰丁香酮50 mg/L+维生素C 0.1 g/L的MS固体培养基中于24℃、遮盖黑暗条件下共培养1~2天； 所述侵染菌液由如下方法制备：取过夜培养的发根农杆菌K599菌液，转入含乙酰丁香酮10 mg/L As +黄瓜碱10 mg/L的 YEB液体培养基中，28℃、200 r/min活化处理4小时，活化后的菌液离心、弃上清，留沉淀在离心管中加入含乙酰丁香酮20 mg/L 的MS液体培养基将菌体悬浮；离心、弃上清，留沉淀在离心管中加入含乙酰丁香酮20 mg/L 的MS液体培养基将菌体悬浮；离心、弃上清，取沉淀用含乙酰丁香酮20 mg/L 的MS液体培养基稀释，制成侵染菌液（3）毛状根的诱导：共培养后的茎段外植体经彻底清洗去除表面水分和菌液，转入含吲哚乙酸0.5 mg/L+维生素C 0.1 g/L+半胱氨酸0.1 g/L+ 特美汀500 mg/L的MS固体培养基或含吲哚乙酸0.5 mg/L + 维生素C  0.1 g/L +聚乙烯基吡咯烷酮0.1 g/L+特美汀500 mg/L的MS固体培养基中，于24℃、黑暗条件下培养30~45 d，获得毛状根；（4）毛状根的繁殖：当毛状根长度达到2~3 cm时，切取三叶青毛状根，进行除菌操作后，经鉴定后转到含吲哚乙酸 0.1 mg/L的MS固体或液体培养基或不添加任何植物激素的MS固体或液体培养基上进行繁殖。