核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的建立及鉴定方法

摘要

本发明公开了一种核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的建立方法，选择最有效RNA干涉靶序列，在体外合成两段互补的寡核苷酸，利用载体上的BamH Ⅰ和Cla Ⅰ酶切位点，将Fut8基因siRNA片段重组到逆转录病毒质粒pSINsi-hU6中。经293T细胞包装后，重组逆转录病毒滴度可达2.1×105CFU/ml，产生的重组逆转录病毒感染前B细胞株通过400-1000ug/ml G418筛选获得稳定表达株。用Real time-PCR及高效液相色谱（HPLC）检测结果表明，Fut8siRNA复制缺陷型重组逆转录病毒感染70Z/3细胞中，Fut8mRNA及酶活性显著下降。本发明具有操作简单，基因沉默效率高、重复性好等优点。Fut8基因沉默细胞模型的建立为Fut8基因生物学功能研究奠定了基础。

主权项

一种核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、根据Fut8基因序列，设计1条21个核苷酸双链Fut8siRNA序列：CUGAUCACU CCAGCAGAGA（759‑778）；并设计Fut8siRNA双链短发夹结构：siRNA‑sense:5′‑GATCCACTGATCACTCCAGCAGAGATTCAAGAGATCTCTGCTGGAGTGATCAGTTTTTTAT‑3′;siRNA‑antisense:5′‑CGATAAAAAAACTGATCACTCCAGCAGAGATCTCTTGAACTCTGCTGGAGTGATCAGTG‑3′S2、将该条Fut8siRNA片段重组到逆转录病毒质粒pSINsi‑hU6中，构建pSINsi‑hU6‑Fut8siRNA载体；S3、Fut8基因沉默细胞模型的建立，包括如下分步：S31、用脂质体转染法将pSINsi‑hU6‑Fut8siRNA，pE‑ampho载体，pGP载体共同转染293T细胞，包装携带有pSINsi‑hU6‑Fut8siRNA的逆转录病毒；S32、将3‑5×104靶细胞进行9‑12h培养，利用7‑10ug/mL polybrane孵育后，通过病毒感染方式将Fut8siRNA转染至靶细胞内；S33、用400‑1000ug/ml G418进行筛选，并挑取单个细胞，进行扩大培养，获得稳定的Fut8基因沉默细胞模型。